[发明专利]使用壮观霉素选择的植物转化方法

权利要求书

1.一种产生包含至少两种异源核酸序列的转基因植物的方法， 包括：

(a)提供包含赋予除草剂抗性的第一异源核酸序列的外植体；

(b)转化该外植体以包含第二异源核酸序列，该第二异源核酸序 列含有赋予壮观霉素抗性的可选择标记基因；和

(c)再生显示壮观霉素抗性的外植体成为包含至少两种异源核酸 序列的转基因植物。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述外植体包含胚分生组织。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一异源核酸序列赋予 对草甘膦、双丙氨膦、草胺膦、Basta、草丁膦、2，4-D、卡那霉素和相 关的氨基糖苷类、潮霉素、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、产氧自由基物 质或麦草畏的抗性。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述外植体是大豆、玉米、 棉花或油菜外植体。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述外植体是大豆或棉花外 植体。

6.一种产生转基因植物的方法，包括：

(a)用包含赋予壮观霉素耐受性的可选择标记的异源核酸序列转 化至少第一种子外植体；和

(b)从转化的细胞再生转基因植物，其中在步骤(a)或步骤(b)之 前、同时和/或之后，将外植体与包含壮观霉素的至少第一培养基接 触，以选择包含所述可选择标记的转化细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述转基因植物是由导致种 系组织转化的分生组织产生的。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述产生的植物是非嵌合的。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述产生的植物是嵌合的。

10.如权利要求6所述的方法，其中，所述第一种子外植体包含转 基因。

11.如权利要求6所述的方法，其中，所述外植体在步骤(a)之前， 在0-15℃的温度下存储1小时-7天。

12.如权利要求6所述的方法，其中，所述外植体包含胚分生组织。

13.如权利要求6所述的方法，其中，所述培养基包含大约15mg/L- 大约1500mg/L的壮观霉素。

14.如权利要求6所述的方法，其中，所述外植体的细胞包含赋予 对草甘膦、双丙氨膦、草胺膦、Basta、草丁膦、2，4-D、卡那霉素和相 关的氨基糖苷类、潮霉素、链霉素、氨苄青霉素或麦草畏的耐受性的 编码序列。

15.如权利要求6所述的方法，其中，在步骤(a)的过程中或之后， 所述外植体在35℃-40℃下，在选择剂的存在下培育，和/或在允许正 常质体发育的光照条件下培育。

16.如权利要求15所述的方法，其中，培育在35℃-40℃下进行 1-7天，或光照条件包括至少5微爱因斯坦、大约16小时光照/8小时黑 暗的光周期。

17.如权利要求6所述的方法，其中，所述步骤(a)包括在包含壮观 霉素的共培养基上培育外植体。

18.如权利要求17所述的方法，其中，在从共培养基转移后，所 述外植体不与包含壮观霉素的培养基接触。

19.如权利要求17所述的方法，其中，在从共培养基转移后，所 述外植体与包含壮观霉素的培养基接触。

20.如权利要求6所述的方法，其中，无需在无菌培养基中预生 根，将再生为植物的外植体转移到土壤或土壤替代物中来生根。

21.如权利要求6所述的方法，其中，所述异源核酸进一步包括赋 予农艺学上的目标性状或改善的最终用途的编码序列。

22.如权利要求6所述的方法，其中，所述步骤(a)包括用至少第二 异源核酸转化外植体的细胞。