[发明专利]核酸检测

权利要求书

1.一种用于从样品的核酸总体中，富集和/或检测包含至少一个变异的核苷酸的目标 核酸的方法，所述方法包括：

(a)用所述目标核酸序列第一链的富集引物和扩增引物处理所述样品，以形成双链 体的混合物，

其中所述双链体的混合物包括在杂交条件下与所述目标核酸模板退火的所述富集引 物，

其中所述富集引物的核苷酸序列能与所怀疑的变异核苷酸所处的诊断区域互补，

其中所述富集引物包含至少一个令所述富集引物的延伸产物不适合指数扩增的化学 基团部分，富集引物3’末端核苷酸与底物正常核苷酸互补，从而与怀疑的变异核苷酸不互 补，这样使得富集引物当与底物含有变异核苷酸杂交时是不能延伸，当与底物含有正常核 苷酸杂交时能延伸；

并且其中所述扩增引物能以令所述扩增引物的3’端与所述富集引物的5’端紧邻或位 于所述富集引物5’端上游的方式，与所述目标核酸退火；

(b)将上述步骤(a)的混合物置于包含适当的核苷三磷酸和核酸聚合酶的延伸条件， 以延伸可被延伸的退火的引物，从而合成引物延伸产物，

其中所述富集引物的延伸允许包含所述变异核苷酸的所述目标核酸的扩增，

其中当所述富集引物与包含所怀疑的变异核苷酸的所述诊断区域退火时，退火的富集 引物不能被延伸，所述富集引物由此在延伸条件下与所述目标序列解离，从而允许所述扩 增引物的延伸通过包含所怀疑的变异核苷酸的所述诊断区域，其中当所述富集引物与包含 相应的正常核苷酸的所述诊断区域退火时，退火的富集引物得到延伸以合成所述富集引物 的延伸产物，所述扩增引物的延伸由此被所述富集引物的延伸产物所阻碍。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括在扩增反应中重复步骤(a)和 (b)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述化学基团部分为不适合作为核酸聚合酶模板 的阻碍部分，其中所述富集引物的复制被阻碍。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述阻碍部分为碳氢化合物臂、非核苷酸键、核 苷酸衍生物、碱基核糖或者染料。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述阻碍部分为肽核酸。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述阻碍部分位于距所述富集引物的3’末端少 于3个核苷酸处。

7.根据权利要求3所述的方法，其中所述阻碍部分位于距所述富集引物的3’末端少 于6个核苷酸处。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述阻碍部分位于距所述富集引物的3’末端少 于18个核苷酸处。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述富集引物包含令所述富集引物 的全部或部分能抗核酸酶裂解的修饰的核苷酸或键。

10.根据权利要求2所述的方法，其中所述扩增反应为PCR。

11.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，所述反应混合物还另外包含针 对所述目标序列的第二链的富集引物和/或扩增引物，其中所述第二链与所述目标序列的 第一链互补。

12.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括检测富集的所述目标核酸。