[发明专利]修饰微生物

说明书

技术领域

本发明涉及用于产生有用的蛋白质或多肽的微生物，以及产生该 蛋白质或多肽的方法。

背景技术

微生物用于工业生产多种有用物质，包括食品，如酒精饮料、味 噌、和酱油，还包括氨基酸、有机酸、核酸相关物质、抗生素、糖类、 脂质和蛋白质。这些物质具有广泛的应用，诸如食品、药物、洗涤剂、 化妆品和其他日用品、以及作为多种化学产品的原料。

在微生物中，革兰氏阳性细菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大 芽孢杆菌具有非常高的分泌多种胞外酶的能力，诸如淀粉酶、蛋白酶 和脂肪酶。实际上，目前在工业中应用许多由杆菌产生的胞外酶。由 细菌作为分泌物产生某些蛋白质的有用之处在于，例如，分泌的蛋白 质通常具有其天然结构，并且因此分泌的蛋白质可很容易被纯化。因 此，改善此类细菌株以便增加特定分泌性蛋白质的分泌和产生量是非 常有意义的。

位于原核生物的外膜和周质间隙的许多蛋白质通过Sec转位机构 介导而通过细胞质膜。建立了一种由SecY/SecE/SecG组成的异三聚体 膜蛋白复合体、和与SecD/SecF/YajD异三聚体膜蛋白复合体弱结合的 外周结合的二聚SecA制成的跨膜通道，并且该蛋白借助于来自SecA 的ATP水解产生的能量转位而通过膜。已知如果细菌是大肠埃希氏杆 菌，则通过分子伴侣SecB识别前分泌蛋白质，并且传递至细胞质膜表 面上的SecA。在枯草杆菌中仍然没有识别出与分子伴侣SecB同源的 因子，但相信枯草杆菌具有SRP(信号识别粒子)，特征性地参与跨 真核生物的内质网膜的转位、以及分泌蛋白质从SRP向SecA的移交。 已经显示枯草杆菌的SecA由两个结构域组成，N结构域和C结构域， N结构域具有ATP结合位点I(ABS I)和信号肽结合位点，C结构域 具有参与SecA二聚作用并且与SecY相互作用的位点、以及与大肠埃 希氏杆菌的SecB结合位点同源的区域，并且ATP结合位点II(ABS II) 以与两个结构域排列的方式存在。

到目前为止，已有报道遗传修饰，诸如蛋白酶的删除(非专利文 件1)、PrsA产生的增加(非专利文件2)、SecD/SecE/SecDF的过度表 达(专利文件1)、以及SecG的过度表达(专利文件2)，作为用于增 加蛋白质的分泌产生的技术。

然而，对于使SecA的一些氨基酸残基缺失以增加蛋白质的分泌产 生还没有报道。

[非专利文件1]Olmos-Soto J，Contreras-Flores R.Genetic system constructed to overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis(构建 为在枯草杆菌中过度产生和分泌胰岛素原的遗传系统).Appl. Microbiol.Biotechnol.2003 Sep；62(4)：369-73。

[非专利文件2]Vitikainen M，Hyyrylainen HL，Kivimaki A， Kontinen VP，Sarvas M.Secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis can be improved by engineering cell components affecting post-translocational protein folding and degradation(通过设计影响转位后 蛋白质折叠和降解的细胞成分能够改善在枯草杆菌中分泌异源蛋白 质).J Appl Microbiol.2005；99(2)：363-75。

[专利文件1]WO99/04007

[专利文件2]WO99/04006

发明内容

本发明具有下列1)至3)方面。

1)一种微生物，其被基因修饰以使secA的60-80个羧基末端氨 基酸缺失；

2)一种重组体微生物，其通过将编码异源蛋白质或多肽的基因 导入修饰微生物株中而构建；以及

3)一种使用重组体微生物产生蛋白质或多肽的方法。

附图说明

图1a是SAN819和SAN780株的secA基因位点周围的基因组结 构的视图；

图1b是确认在SAN819和SAN780株中表达的SecA的大小的电 泳图谱；

图2a是构建干扰素表达载体的方法的视图；