[发明专利]IX型胶原破坏的诊断

说明书

发明领域

本发明涉及通过测定血清和滑液中由IL-1介导的IX型胶原切割片段的水平来检测或监测影响结缔组织紊乱的方法，例如关节病，尤其是骨关节炎、类风湿性关节炎、反应性关节炎、腱断裂、骨质疏松症、骨软化症、骨折修复和动脉硬化。更具体地说，本发明涉及检测或监测蛋白片段的存在，该片段是在IX型胶原α1链N-末端部分附近的新的切割位点切开，或更确切地，在接近NC4结构域，和接近于NC3结构域的COL3结构域的C-末端部分切开。本发明还公开了对抗由切割产生的新表位和在IX型胶原独特的NC4结构域N-末端部分切割的表位的新表位抗体。还提供了对实施这种方法有用的诊断试剂盒和抗体。

背景技术

在透明软骨IX型胶原中，存在纤维网的次要成分，该纤维网具有作为主要成分的II型胶原。IX型胶原分子是由多肽链α1、α2和α3组成的异源三聚体(2)。它属于具有间断的三螺旋(FACIT)的原纤维缔合胶原。每条链含有被四个非三螺旋结构域NC1、2、3和4环绕的三螺旋(胶原的)结构域COL1、2和3(3)，(也参见图9)。结构域编号从C-末端开始计算。

使用电子显微术已经表明IX型胶原修饰II型胶原原纤维的表面，NC4结构域形成球状结构，该球状结构与类似COL3结构域的柱一起从II型胶原纤维伸出(4)。

IX型胶原通过与II型胶原和其他类型IX型胶原分子结合而与II型胶原纤维共价交联(5-7)。这些键使得基本不可能用不切割肽键的试剂从成熟软骨中提取IX型胶原。

已经表明NC4结构域对很多分子具有亲和力，例如肝素和软骨寡聚基质蛋白(COMP)(8-10)，而COL结构域与胞外基质蛋白-3相互作用(11)。已经在一种罕见的遗传性不同种类范围的影响生长和骨骺骨化的疾病-多发性骨骺发育不良患者中发现了相互作用性COMP、MATN-3和COL9中的突变(12)。

现在令人惊讶地表明NC4-片段是软骨破坏的生物标志。切割发生在软骨的一种主要结构成分聚集蛋白聚糖释放之后，和主要胶原降解之前。与胶原标志相比，NC4-片段是“不可逆点(point of no return)”之前引起破坏过程的标志，胶原标志类似X线观察是破坏过程晚期的结果。聚集蛋白聚糖相关标志在降解发展早期以及在组织正常适应期间释放，因此不能明确地表示病理过程。此外聚集蛋白聚糖标志常常与炎症相关联。

本发明描述的切割NC4后，保留与II型胶原交联的大部分IX型胶原可能被进一步切割，并在稍后阶段释放。本发明这里公开的对抗所释放片段的新C-末端的新表位抗体可以检测到这种切割。另外，本发明公开的新表位抗血清可用在免疫组织化学法中测定软骨中(浅表-深处、细胞周-细胞间)是否发生了这里报道的新切割。最初保留在组织中的新形成的N-末端片段的抗体可以检测这种片段释放的后期。使用col3结构域切割产生的新表位可以获得对时期的更多信息。很多在先出版物和专利申请描述了特异性结合IX型胶原的单克隆抗体，但是他们中无一提及特异性对抗接近NC4的切割位点的新表位抗体。

专利申请WO1990008195A1公开了对应于人IX型胶原的片段的寡肽有效作为生产单克隆抗体的抗原，该抗体在免疫原性上结合人IX型胶原和由其衍生的片段。然而该专利申请中提及的片段不涉及IX型胶原的病理破坏，因此预料不到与关节炎相关联。

在WO2004110475A 1中，委派了Inst of Nutraceutical ResearchPTY，该发明涉及包含NC4结构域的组合物，用于治疗和耐受诱导具有关节炎症状的个体。该发明人还描述了从结缔组织回收具有抗关节炎活性或抗炎活性的多肽的方法。正如上述提及的专利申请，抗体对抗未切割IX型胶原，不是新表位抗体。此外申请人没有提及NC4作为诊断标志。

专利申请WO1999021011A1，委派Fibrogen Inc，披露了通过测定血清中IX型胶原水平来检测或监测自身免疫紊乱和结缔组织紊乱的方法。当制备抗IX型胶原的抗体时，选择NC4结构域的N末端部分中的序列。这个抗体对抗未切割IX型胶原且不针对像本发明这里的独特的切割新表位。

以前文件无一描述NC-4结构域中存在的引起这个结构域专一释放的特异性切割位点。尽管事实上在某些疾病中组织被完全破坏，但是不能推断或预知切割特性。也不能预料牛软骨和人软骨中分子的切割不同，尤其是考虑到序列相似性(图10)。

因此，特异性切割位点的发现是新的并开发了新诊断发明。