[发明专利]用于检测JAK2基因的突变的探针及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测与慢性骨髓增殖性疾病(chronic myeloproliferative disorder；CMPD)相关的JAK2基因的突变的 探针及其用途。

背景技术

作为在基因水平上分析所有疾病的原因、以及个体间疾病 易患性(患病的难易程度)、个体间药效差异等的方法，点突变， 即单核苷酸多态性(SNP)的检测被广泛应用。

作为SNP的通常检测方法，可举出：(1)扩增发生检测目 标的突变的区域，对所得扩增产物的碱基序列进行分析的直接 测序(Direct Sequencing)法，(2)焦磷酸测序(Pyrosequencing) 法，(3)扩增上述区域，在温度梯度柱中进行HPLC，根据洗脱 时间检测有无突变的变性高效液相色谱(Denaturing HPLC)法， (4)利用荧光探针与含有检测目标的突变的区域结合则发出荧 光的现象，通过测定荧光强度来检测突变的侵入检测(Invader) 法，(5)使用将3’末端区域的任一个碱基设计成与检测目标的 突变互补的碱基的引物来进行PCR，根据是否发生扩增来判断 突变的ASP(Allele Specific Primer)-PCR(Polymerase Chain Reaction)法(等位基因特异性引物PCR法)等。

但是，上述(1)、(2)和(4)方法的灵敏度较低，分别为 约20％、约5％、约5％左右，操作需要很多功夫和时间。上述 (3)的方法的灵敏度低达约10％，另外，仅能确认有无突变， 而无法分析在何位点产生了何种突变，具有缺乏特异性的问题。 另外，上述(5)的方法虽然灵敏度高，但特异性低，具有易于 产生假阳性的问题。予以说明，灵敏度的数值(％)越小则灵 敏度越高。

由该问题出发，作为SNP的检测方法，近年正在使用如下 所示的Tm(Melting temperature，解链温度)分析。该方法首 先使用与含有检测目标的SNP的区域互补的探针，以形成待测 体的核酸与上述探针的杂交体(双链核酸)。然后，对该杂交体 进行加热处理，通过测定吸光度等信号来检测随着温度上升的 杂交体向单链的解离(融解)。根据该检测结果确定Tm值，从 而判断SNP的方法。杂交体的同源性越高则Tm值越高，同源性 越低则Tm值越低。因此，例如，首先，预先求出含有突变型的 SNP的核酸和与其互补的探针的杂交体的Tm值(评价基准值)。 接着，测定待测体的核酸与上述探针的Tm值(测定值)。然后， 若该测定值与上述评价基准值相同，则可判断为完全匹配，即， 待测体核酸的SNP为突变型。另一方面，若上述测定值低于上 述评价基准值，则可判断为错配，即，待测体核酸的SNP为正 常型。但是，这种使用Tm分析的检测方法，普遍存在灵敏度较 低的问题。

据报道，真性红细胞增多症(Polycythemia vera；PV)、原 发性血小板增多症(essential thrombocythemia；ET)等慢性骨 髓增殖性疾病(CMPD)中，可高频率地发现JAK2基因的突变 型SNP(非专利文献1～4)。上述突变型SNP为JAK蛋白质的第 617位缬氨酸(V)被替换成苯丙氨酸(F)的突变，JAK2基因 的外显子12的第73位(成熟mRNA(CDS)的第1849位)的鸟 嘌呤被胸腺嘧啶替代(JAK2/V617F)。研究认为，表达这种 蛋白质的JAK2基因的突变(JAK2/V617F)的检测，对CMPD 的诊断及治疗有用。但是，即便是同一位患者的血液样品，其 血液样品中也会包括含有产生突变型SNP的突变JAK2基因的 血液细胞和含有正常型SNP的正常JAK2基因的血液细胞。这些 基因的不同，仅仅是SNP的类型，即，仅一个碱基的不同。这 样，用于检测突变型SNP的探针，会与含有突变型SNP的突变 序列(检测对象序列)因完全匹配而杂交；虽与含有非突变型 SNP的正常型SNP的正常序列(非检测对象序列)有一个碱基 错配，但也发生杂交现象。这种情况下，存在如下问题：在Tm 分析中，做成表示信号强度与温度间关系的融解曲线时，属于 完全匹配的突变序列的高温侧峰会因属于错配的正常序列的低 温侧峰的存在而难以检测。即，即便存在突变序列时，其检测 也会由于正常序列的存在而变得困难，导致检测灵敏度下降。

非专利文献1：Tefferi A.Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2006；240-245.