[发明专利]成像探针

说明书

本发明涉及使得可以观察单个蛋白水解酶或蛋白水解酶组在体外试 验、在细胞或多细胞有机体中的催化活性的分子探针(底物)。本发明还涉 及所述探针(底物)的合成和设计方法。

发明背景

蛋白水解酶(蛋白酶)裂解或降解活细胞内和活细胞外的其它酶或肽。 蛋白酶与大量的生命过程有关，其中许多蛋白酶在细胞信号传导和组织内 稳态中起重要作用。活性异常或提高的蛋白酶与许多种疾病相关，包括： 癌症、骨关节炎、动脉硬化、炎症以及许多其它疾病(M.J.Evans，B.F. Cravatt，Chem.Rev.2006，106，3279-3301)。由于蛋白水解活性在生命系统 中必须保持在严格控制下，许多蛋白酶被表达为非活性前体蛋白(酶原)， 其通过受控的蛋白酶剪切而活化。对蛋白水解活性的另外控制来源于内源 性抑制剂，所述内源性抑制剂结合并从而使催化活性形式的酶失活。考虑 到这种严格的调控，研究在细胞或生理事件中的蛋白酶功能需要监测蛋白 酶的活性而非仅监测蛋白酶的表达。相应地，文献中提出了许多基于化学 探针的活性。通常应用的蛋白酶探针(i)通过肽键的酶裂解导致荧光团从荧 光淬灭剂中空间上分离或(ii)通过基于机制的抑制剂与感兴趣蛋白酶的共 价结合而产生可探测的信号。定位和定量研究特定蛋白酶或蛋白酶组的活 性和抑制(例如在基于细胞的测定或全动物成像实验中)需要开发成像探 针，所述探针(i)到达蛋白酶功能的生理相关部位(例如，全动物成像中特定 的器官或细胞溶胶)并且(ii)对期望的蛋白酶或蛋白酶组而言是选择性的。选 择性蛋白酶探针的出现为本领域带来了巨大的变化。本发明涉及(i)新的高 选择性半胱氨酸蛋白酶探针，优选来自组织蛋白酶亚家族的半胱氨酸蛋白 酶，(ii)所述探针在体外测定、细胞或多细胞有机体中的应用(例如，利用分 子成像手段)以及(iii)合成和设计这些探针的方法。

在最近几年中，一些分子成像技术(光学的和非光学的)对体内特定分 子靶点和通路的非侵袭性显影已变得越来越重要。由于任何影像信号的信 息内容最初都是内部对比的函数，可由酶促反应(例如，肽键的裂解)活化 的内部淬灭成像探针的开发已被常规地应用于成像和定位催化活性的蛋白 酶。通过常规方法难以实现产生对单个蛋白酶有选择性并显示到达体内蛋 白酶作用部位能力的探针。制药工业中的药物化学家在开发具有适当药动 学性质和对给定靶点有适当特异性的药物中面临相关挑战。在本发明中我 们设计了基于对半胱氨酸蛋白酶选择性活性的探针的新途径，并对来自半 胱氨酸组织蛋白酶亚族的蛋白酶应用这种方法。

半胱氨酸蛋白酶的特征是位于活性位点的、在催化过程中作为亲核基 团的半胱氨酸残基。催化性半胱氨酸通常与适当的邻近残基通过氢键结合， 以便能够形成硫醇根离子。当通过蛋白酶识别到底物时，易裂解的肽键位 于接近催化性半胱氨酸处，所述半胱氨酸进攻羰基碳形成氧负离子中间体。 然后酰胺键被裂解，释放C端的肽作为胺。易裂解的肽的N端部分保持在共 价的酰基-酶中间体中，该中间体随后经水裂解，导致酶的再生。底物的N 端裂解产物作为羧酸释放。

人基因组编码11种木瓜蛋白酶样组织蛋白酶(人族CA蛋白酶或半胱氨 酸组织蛋白酶：B、C、F、H、K、L、O、S、V、W、X)，其涉及许多功 能，包括：溶酶体中常规蛋白降解(持家(house keeping)功能)、抗原加工、 颗粒蛋白酶加工以及基质胶原的降解。半胱氨酸组织蛋白酶的功能障碍与 很多病理事件相关，例如骨关节炎、肿瘤生物学(血管发生和肿瘤形成)、 神经性障碍(例如疼痛)和骨质疏松症(Y.Yasuda等人Adv.Drug Delivery Rev.2005，57，973-993)，因此近年来某些半胱氨酸组织蛋白酶被确认为用 于治疗的相关药物靶点(Turk，V.；Turk，B.；Turk，D.Embo J，2001，20， 4629-4633)。

例如，组织蛋白酶K和S涉及骨和软骨的降解，并涉及骨质疏松症和关 节炎。