[发明专利]一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法

说明书

技术领域

一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法，涉及由杜氏盐藻制备硫酸化杂多糖和核酸多糖的分离纯化方法，属于盐藻生物技术及其制品、色谱分离技术领域。

背景技术

杜氏盐藻(Duanaliella salina)是单细胞、无细胞壁的绿藻类浮游生物，既是重要的一类海洋微藻，也可养殖于内陆盐湖。杜氏盐藻中存在着丰富的、构成独特并具有多种生理活性的初级和次级代谢产物——除有高含量的天然β-胡萝卜素外，还含有丰富的多糖、蛋白质、不饱和脂肪酸等多种生物活性物质及人体所需的矿物质。这些生理活性物质在防治心血管疾病、肿瘤和抗辐射及抗病毒、免疫调节等方面具有良好的应用前景。盐藻生物技术及其制品的开发已成为国际海洋生物界关注的重点。然而，目前人们大规模培养杜氏盐藻主要用于生产β-胡萝卜素，而其中高达10％-40％的多糖类物质的研究利用较少，对其多糖的分离纯化缺乏系统深入的研究，己有报道的盐藻多糖产品均为糖蛋白或以葡萄糖为主的杂多糖，有关应用离子交换色谱--磷酸盐缓冲液离子强度梯度洗脱法结合凝胶过滤色谱—NaAc水溶液梯度洗脱分离法从盐藻中制备核酸多糖和以半乳糖为主、同时含有较高含量阿拉伯糖和木糖的硫酸化杂多糖的方法均未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法，以利用杜氏盐藻中的多糖成份。

本发明的技术方案：一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法，以提取出β-胡萝卜素后的杜氏盐藻粉为原料，根据盐藻多糖的特点，采用在碱性条件下热水浸提，以等电点法结合Sevag法除蛋白，乙醇沉淀析出多糖，再用离子交换色谱---磷酸盐缓冲液离子强度梯度洗脱法结合凝胶过滤色谱—NaAc水溶液梯度洗脱法分离纯化得到包括一种硫酸化杂多糖和一种核酸多糖共五个杜氏盐藻多糖均一组分，步骤为：

(1)浸提：取一定量提取出β-胡萝卜素后的杜氏盐藻粉，用pH8.5～10.0的2mol/L NaOH水溶液于水浴加热提取，液料比mL/g计为10:1～16:1，提取温度70～90℃，提取时间2～4小时，提取2次，合并提取液，得到藻多糖提取液；

(2)等电点法除蛋白：提取液采用等电点法除去大部分蛋白：用2mol/L HCl调pH为3.5～4，4000r/min离心20min，得到上清液；

(3)沉析：上清液用3.8倍体积的95％乙醇沉淀，静置，离心，抽滤，取滤饼真空干燥或冻干得到盐藻多糖粗提物；

(4)Sevag法进一步除游离蛋白：将盐藻多糖粗提物加入一定量的去离子水溶解得样液，用Sevag法进一步去除游离蛋白，将氯仿:丁醇体积比4:1的Sevag试剂加入样液中，所用Sevag试剂体积为样液体积的1/5，充分振荡，离心去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，重复3～5次；取水相透析MWCO 3500Da，并适当浓缩后即得到初步纯化的盐藻多糖浓缩液，用于下步色谱分离；

(5)离子交换色谱分离：取步骤(4)中得到的盐藻多糖浓缩液上样50mL于DEAE-Sepharose Fast folw柱，3.5cm×30cm，进行离子交换色谱分离，用含NaCl的pH值为6.8～7.8的0.02mol/L磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，NaCl浓度由0.01mol/L到1.0mol/L，流速为6～9mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法，波长490nm，逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测；根据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析、浓缩；得到4个多糖级分PD1、PD2、PD3和PD4；PD1、PD2和PD3进行冻干；PD4用于后续进一步分离纯化；

(6)凝胶过滤色谱分离：多糖级分PD4上Sepharose CL 6B柱，2.6cm×100cm，进行凝胶过滤色谱分离，用0.1mol/L NaAc洗脱，流速为0.3～0.6mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法，波长490nm，逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测；依据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析和浓缩、冻干，得到2个多糖级分，即硫酸化杂多糖PD4a和核酸多糖PD4b。

本发明的有益效果：本发明以提取出β-胡萝卜素后的杜氏盐藻粉为原料，在碱性条件下热水浸提，以等电点法去除大部分蛋白，用乙醇沉淀法析出多糖，以Sevag法进一步去除残余蛋白，再采用离子交换色谱-离子强度梯度洗脱法结合凝胶过滤色谱法分离纯化，分部收集，适当浓缩后冷冻干燥得到包括一种以半乳糖为主、同时含有较高含量阿拉伯糖和木糖的硫酸化杂多糖及一种核酸多糖共五个杜氏盐藻多糖纯一级分。本发明方法简单实用，成本低，利于推广、开发与应用。

附图说明