[发明专利]一种微囊藻毒素-LR单抗免疫亲和柱的制备和使用方法

权利要求书

1.一种微囊藻毒素-LR单抗免疫亲和柱的制备方法，其特征是：

(1)用水溶性碳二亚胺法制备微囊藻毒素-LR与牛血清白蛋白BSA偶联物，以下简称MC-LR-BSA，微囊藻毒素-LR简称MC-LR，用MC-LR-BSA作为免疫原，用混合酸酐法制备MC-LR与载体蛋白OVA的偶联物，以下简称MC-LR-OVA，用MC-LR-OVA作为检测抗原，通过免疫方法获得MC-LR单抗；

(2)琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化：用溴化氰法活化琼脂糖凝胶Sepharose 4B，活化过程如下：

(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分两次洗涤后抽干，加少量的0.1mol/L pH8.3的NaHCO₃洗涤，立即转入100mL烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；

(b)在通风橱内称取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反应完全，pH保持不变，停止搅拌；

(c)将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L pH8.3的NaHCO₃抽洗；

(3)MC-LR单抗免疫亲和柱的制备：

将MC-LR单抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到的亲和吸附剂，填充入柱中得到MC-LR单抗免疫亲和柱，简称IAC，操作步骤如下：

(d)偶联

将制备纯化好的MC-LR单抗置于pH8.3含有0.5mol/L NaCl的0.1mol/LNaHCO₃的偶联缓冲液中透析12h；将上述活化好的Sepharose 4B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR单抗溶液中进行偶联，紫外扫描监控偶联过程；用5倍MC-LR单抗溶液体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的MC-LR单抗，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；收集全部的洗脱液，通过测定其蛋白质的含量计算未偶联上MC-LR单抗的量；

(e)封闭活性基团

将琼脂糖-抗体偶联复合物转入5倍体积pH8.0的含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭Sepharose 4B中多余的活性基团；

(f)洗涤

步骤(e)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物依次用5倍偶联复合物体积的pH4.0的含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH8.0的含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用5倍偶联复合物体积的PBS洗涤两次；

(g)防腐处理

步骤(f)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃密闭保存；

(h)装柱

将步骤(f)或(g)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，即制成MC-LR单抗IAC；

(i)保存

琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的MC-LR单抗IAC切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内；

(j)IAC的再生

IAC使用后，用4-10个柱床体积pH8.5含0.5mol/L NaCl的0.1mol/LTris-HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L醋酸钠缓冲液轮流清洗IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱内供下次使用。

2.权利要求1所述方法制备的MC-LR单抗IAC的使用方法，其特征是：

(1)采集的蓝藻水华经晾晒干燥后，粉碎并过100目筛，干燥藻粉室温干燥保存；

(2)蓝藻样品前处理

取0.1g干藻粉加20mL 80％甲醇水溶液室温下置于超声波细胞破碎仪中提取30min，3000rpm离心10min，收集上层清液，沉淀再重复抽提两次，合并上清液并过滤，滤液减压浓缩至少于1mL，加10mL去离子水稀释；SPE柱先分别用2mL纯甲醇、2mL去离子水预处理；稀释后的滤液过SPE柱富集；再分别用5mL去离子水、5mL 10％的甲醇水溶液冲洗SPE柱后用5mL纯甲醇洗脱柱上藻毒素；IAC使用前先用2mL纯甲醇、2mL去离子水预处理；洗脱液用甲醇定容至5mL，取10μL，加1mL去离子水后过IAC；IAC用2mL蒸馏水洗后用5mL纯甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干，残留物用1mL甲醇溶解后进LC-MS分析。