[发明专利]重组逆转录病毒载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型重组逆转录病毒载体，其可应用于临床肿瘤免疫 治疗，隶属于医学生物技术领域。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病。由于传统的化学疗法、放 射性疗法以及手术疗法难以治疗患有转移瘤的肿瘤病人，肿瘤免疫学疗法 受到免疫学家和医疗工作者的广泛关注与研究。在临床治疗领域，T细胞 过继转移疗法作为重要的被动免疫疗法已经被成功地应用于血液系统来 源的肿瘤疾病(1，2)。但是对于实体瘤的治疗，T细胞过继疗法近年来 进展缓慢，仅有个别报道用该疗法治疗黑色素瘤患者(3)。目前，T细 胞过继转移疗法的局限性在于：从肿瘤患者体内分离到的T淋巴细胞数量 不足；其免疫活性、肿瘤特异性不高(4)。目前，临床上普遍的做法是 在体外培养肿瘤特异性T淋巴细胞过程中加入重组白介素2(5)，但是 其临床应用的效果不明显。主要原因如下：白介素2可以引起T淋巴细胞 对于Fas受体介导的凋亡途径敏感而使特异性的T细胞凋亡(6)；白介 素2还可以促进调节性T细胞的产生从而抑制肿瘤特异性T细胞功能，进 而阻止免疫系统清除肿瘤(7、8)。过继转移免疫细胞进入肿瘤病人体内 也有一定风险，即转入的免疫细胞可能会引起严重的自身免疫性疾病以及 T细胞淋巴瘤。这种风险在将白介素2基因或白介素15基因转染入T细 胞后会有所增加。

因此，为了克服T细胞过继转移疗法的上述缺点，本发明人进行了本 发明。

发明内容

本发明的目的是为了克服T细胞过继转移疗法的上述缺点，提供一种 新型重组逆转录病毒载体，所述重组逆转录病毒载体不但能够大量扩增肿 瘤患者的T淋巴细胞并保持其肿瘤抗原特异性从而提高治疗效果，而且同 时可以清除基因改造过的细胞，避免其在体内增殖所导致的自身免疫性疾 病以及淋巴瘤，确保生物治疗的安全性。

因此，本发明提供一种新型重组逆转录病毒载体，其特征在于包括人 白介素15基因(SEQ.ID.No.1，全长490bp，NCBI GeneBank序列登记 号为：NM000585)和胸苷激酶基因(HSV-TK，SEQ.ID.No.3，全长序 列：1131bp，NCBI GeneBank序列登记号为：AB178228)，以及真核启动 子hEF1-HTLV序列，其中所述胸苷激酶基因是一种自杀基因。将该重组 逆转录病毒载体命名为IL15-TK，本发明人已于2008年12月22日将携 带该重组逆转录病毒载体IL15-TK的反转录病毒TK-L15 Retrovirus保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京 朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏登记号为：CGMCC No.2810。

本发明的重组逆转录病毒载体IL15-TK可在体外大量扩增T淋巴细胞 并且保持其肿瘤抗原特异性：该载体可将人白介素15基因导入T淋巴细 胞中，使其自我分泌白介素15刺激自身增殖，同时也可保持其肿瘤抗原 特异性。但是，自我分泌白介素15的T淋巴细胞有可能导致自身免疫性 疾病以及T淋巴细胞瘤，而将自杀基因(胸苷激酶)一同导入T淋巴细胞 能够避免这种情况发生，从而确保生物医学治疗的安全性。

本新型重组逆转录病毒载体IL15-TK含有人白介素15和胸苷激酶基 因，可感染包括人源、鼠源的各种原代细胞(primary cells)以及细胞系列 (cell lines)。在载体上强启动子的作用下，被感染细胞可大量表达白介素 15和胸苷激酶。

在本发明的一个实施方案中，利用含有HSV-TK的重组逆转录病毒载 体tgls(+)HyTkEF1a-mIL4(质粒图谱参见图1E)(该质粒由德国MDC实验 室Thomas Blankenstein博士馈赠，构建方法参见参考文献16)，酶切去除插 入片段mIL4后载体自连获得tgls(+)HyTkEF1a(在下文中也简称为TK载 体)，在此基础上构建了本发明的重组逆转录病毒载体IL2-TK和IL15-TK， 其中已将携带IL15-TK的反转录病毒TK-L15 Retrovirus于2008年12月22日 保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2810。本发明人重点研究IL15-TK， IL2-TK作为IL15-TK的功能研究的对照。