[发明专利]鸡禽流感疾病抗病育种的方法及专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及鸡禽流感疾病抗病育种的方法及专用试剂盒。

背景技术

随着现代养禽业集约化程度的不断提高，家禽的饲养密度越来越大，家禽传染病对家禽业的影响巨大，一旦暴发，给养禽业带来了巨大的经济损失，影响家禽产品的产量和市场的稳定。此外，人类的现代生活与禽类的关系越来越密切，人类感染动物源性疾病的几率也会有所上升，禽流感病毒的肆虐不但给许多国家的家禽养殖业带来了沉重打击同时也向全人类的健康提出了新的严峻挑战，其中由于H5N1亚型病毒大流行，已经造成了大批禽类死亡和重大的经济损失，并且已经对全球人类健康构成潜在的重大威胁。

组织培养细胞或动物机体细胞在病毒或其它干扰素诱生剂的作用下，可产生一种低分子量的可溶性糖蛋白，即干扰素(Interferon，IF，IFN)。当干扰素进入其它未感染的细胞时，可以诱导细胞产生蛋白质，抑制其它病毒复制。Mx蛋白就是在IFN诱导下产生的蛋白质，是继2′，5′寡腺苷酸合成酶和P86蛋白激酶后发现的又一种抗病毒蛋白。

禽类的Mx蛋白基因具有抵抗禽流感病毒及水疱性口炎病毒(VSV)的功能，禽类是禽流感的自然宿主，因此对禽类Mx蛋白基因进行研究具有重要意义。GED区是Mx蛋白执行抗病毒的功能区域。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡禽流感疾病抗病育种的方法及专用试剂盒。

本发明所述鸡禽流感疾病抗病育种的方法，是检测待测鸡的序列表中序列1所示核苷酸序列的自5′末端第2216位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测鸡的基因型是AA、BB还是AB，采用AA基因型的鸡进行育种；所述AA基因型为序列表中序列1所示核苷酸序列的自5′末端第2216位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述BB基因型为序列表中序列1所示核苷酸序列的自5′末端第2216位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述AB基因型为它们的杂合体。

其中，所述检测待测鸡的序列表中序列1所示核苷酸序列的自5′末端第2216位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法如下：

以待测鸡的基因组DNA为模板，用如下两对引物中的任一对进行PCR扩增：

1)pCF和pAR；

2)pCF和pBR；

以所述pCF和pAR为引物的PCR扩增产物用Tsp509I酶切、以pCF和pAR为引物的PCR扩增产物用CviQI酶切，然后电泳检测酶切产物的片段的大小；所述pCF的核苷酸序列为序列表中的序列2；所述pCR的核苷酸序列为序列表中的序列3；所述pAR的核苷酸序列为序列表中的序列4。

所述方法中，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物，以pCF和pAR为引物，只有两条带，待测鸡的基因型是AA；只有一条带，待测鸡的基因型是AB；只有三条带，待测鸡的基因型是BB；

以pCF和pBR为引物，只有两条带，待测鸡的基因型是BB；只有一条带，待测鸡的基因型是AA；只有三条带，待测鸡的基因型是AB。

所述方法中，用3％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，以pCF和pAR为引物，只有50-100bp的一条带，待测鸡的基因型是AA；只有101bp的一条带，待测鸡的基因型是BB；有两条带，待测鸡的基因型是AB；

以pCF和pBR为引物，只有50-100bp的一条带，待测鸡的基因型是BB；只有101bp的一条带，待测鸡的基因型是AA；有两条带，待测鸡的基因型是AB。

本发明的另一个目的是提供一种辅助检测鸡禽流感抗性的试剂盒。

本发明所提供的辅助检测鸡禽流感抗性的试剂盒，包括引物pCF、引物pAR和限制性内切酶Tsp509I，所述引物pCF的核苷酸序列为序列表中的序列2，所述引物pAR的核苷酸序列为序列表中的序列3。

本发明还提供了另一种辅助检测鸡禽流感抗性的试剂盒，包括引物pCF、引物pBR和限制性内切酶CviQI，所述引物pCF的核苷酸序列为序列表中的序列2，所述引物pBR的核苷酸序列为序列表中的序列4。

其中，所述试剂盒还包括进行PCR的试剂和进行电泳的试剂。

本发明的鸡禽流感疾病抗病育种的方法可以筛选出候选的具有较强抗禽流感能力的品系，对培育抗禽流感病毒的禽类具有重大的经济意义和现实意义。

附图说明

图1为鸡Mx蛋白基因GED区部分序列。

图2为碱基错配设计的区域。

图3为利用错配引物引入酶CviQI或Tsp509I的酶切位点。

图4为酶切产物进行3％的琼脂糖凝胶电泳。