[发明专利]黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，更具体涉及一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法。本发明在黄颡鱼的性别控制和全雄苗种的培育中具有重要的应用价值，同时在其它鱼类性别控制和单性苗种生产中也具有应用前景。

背景技术

黄颡鱼[Pelteobagrus fulvidraco(Richardson)]是具有较高经济价值的底栖鲶形目鲿科鱼类，广泛分布于江河、湖泊、水库等水域。其肉质鲜美，营养丰富，肌间刺少，因而深受消费者青睐。近年来价格较高，市场需求量日益增大。黄颡鱼雄鱼比雌鱼生长快。据调查，在相同养殖条件下，第一年雄性黄颡鱼比同胞雌鱼的生长速度快30％左右。在养殖的第二年，其雄鱼生长至150-200克，而雌鱼却只有50-75克，雌雄生长差异接近3倍。因此，如果能够在育种中人工控制黄颡鱼的性别，培育出全雄黄颡鱼，将大大提高产量，降低养鱼成本，提高经济效益。

生产单性雄鱼有几种方法可供选择：如人工挑选、雄性激素直接诱导性逆转、雄核发育、种间杂交、人工诱导三倍体以及遗传学方法等。目前，使用遗传学的方法生产XY全雄鱼在尼罗罗非鱼单性养殖使用过。这种称为GMT技术，适用于雄性配子异型的鱼类，方法可靠、稳定，而且对环境友好，无不良的影响。

最近刘汉勤等成功地从XY生理雌鱼雌核发育产生了YY超雄鱼，并且通过与XX雌鱼测交得到了全雄子代，验证了YY超雄鱼的存在，说明了该技术路线的可行性，也为全雄黄颡鱼的生产打下了坚实的基础。但当应用到大规模生产中时，该技术存在一些技术瓶颈，阻碍了全雄鱼的生产，比如：生产实践中发现，通过黄颡鱼XY雌鱼雌核发育产生YY超雄鱼的同时，也产生了XY正常雄鱼，其数量与YY超雄鱼不相上下，阻碍了YY超雄鱼在全雄鱼苗培育中的应用。因此如何准确快捷地鉴定开YY和XY雄鱼成为实现全雄黄颡鱼苗规模化生产中的一个关键点。传统的方法只有通过测交实验后，根据子代性别比例，才能判断出其父本为遗传YY或XY雄鱼；而在测交实验中，测交子代需要养殖3个月以上才能解剖根据组织学判断其性别，因此实验周期长，养殖成本高，不利于大规模生产；不仅如此，多年来的繁殖实验，还未发现YY超雄鱼具有和正常XY雄鱼一样的自然繁殖能力；而且黄颡鱼精巢为小叶型，在行人工繁殖时几乎是无法挤出精液的，因此测交实验时，通常要杀掉雄鱼从精巢获得精液进行人工授精。因此无法通过测交实验直接获得活的YY超雄鱼用于持续生产全雄鱼苗。

综上所述，要实现全雄黄颡鱼苗的规模化生产，急需一种经济、快捷、准确且不须杀害黄颡鱼的YY超雄鱼鉴定方法。

随着DNA分子标记技术的发展和成熟，利用DNA标记鉴定性别成为可能，为我们提供一种经济简捷并且准确的遗传性别鉴定手段，但前提是要先筛选到性别特异DNA标记。目前，在一些经济鱼类中，通过各种DNA分子标记技术(RAPDs，RFLPs，SSRs，AFLPs等)筛选性别特异标记已有许多报道，如：Kovacs等利用RAPD扫描非洲鲶鱼(Clarias gariepinus)雌、雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记；Sakamoto等发现两个SSR标记(OmyFGT19 TUF和OmyRGT28 TUF)与雄性虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的性别决定位点相连锁。同时，鱼类的性别特异DNA标记通常具有物种或者品系特异性，一种鱼类的性别特异标记通常不能跨物种使用，因此要利用分子标记实现黄颡鱼的遗传性别鉴定，首先要筛选到黄颡鱼的性别特异标记。

AFLP分子标记技术是一种基于PCR技术的多位点分子标记技术，具有显示出很强多态性的能力。每对AFLP选择性扩增引物能够获得50-100个条带，通过有限的引物组合可以获得大量的扩增片段。因此AFLP分子标记特别适于对尚无分子遗传信息背景的物种进行研究。近五年来AFLP分子标记技术在筛选性别标记研究中得到了较广泛应用，并且有一些成功的报道，如Ezaz等用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus L.)基因组，找到3个Y染色体连锁(OniY425.OniY382.OniY227)和一个X染色体连锁(OniX420)的AFLP标记；Brunelli等应用AFLP也找到了一个新的大鳞大麻哈鱼Y染色体特异的标记。

发明内容