[发明专利]来自海洋的多粘类芽孢杆菌产中性蛋白酶及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋细菌产蛋白酶方法，特别是一种来自海洋的多粘类芽孢杆菌产中性蛋白酶方法，本发明还涉及该方法所产中性蛋白酶。

背景技术

蛋白酶是催化蛋白质水解的酶类的总称。蛋白酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。

中性蛋白酶可广泛应用于皮革脱毛，蛋白水解，果酒、啤酒和饮料中蛋白质的去除。同时细菌蛋白酶在细菌生长过程中具有非常重要的作用，其不仅仅与细菌生长的营养有关，而且还可以破坏宿主蛋白质，是细菌抵抗和侵袭其他病原物的重要物质，如昆虫和线虫的体壁含有蛋白质，细菌寄生于昆虫或线虫上后分泌蛋白酶，降解昆虫或线虫体壁中的蛋白质而杀死昆虫和病原线虫，因而蛋白酶在植物病原线虫和植物真菌性病害的防治上具有重要作用。但目前报道的具有杀昆虫和线虫作用的产蛋白酶微生物主要来自于陆源微生物。而陆源微生物经过多年的分离筛选，得到产新型物质或具有新功能微生物的几率越来越低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用来自海洋的多粘类芽孢杆菌产中性蛋白酶的新方法，该方法操作简单、所产中性蛋白酶活性较强。

本发明还提供了下种如上所述方法所产的中性蛋白酶。

本发明所涉及的菌株多粘类芽孢杆菌L₁-9(Paenibacillus polymyxa isolateL₁-9)为公知公用菌株，该菌株已于2008年9月30日在Genebank公开，登录号为FJ178378，该菌株的16S rRNA序列已公开，网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore&cmd＝search&term＝FJ178378。公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。而且发明人已经于2007年在《河南农业科学》中公开发表了一篇名为《3株抗植物病原真菌的海洋细菌的分离筛选》的论文，该论文中也公开了本发明所涉及的菌株多粘类芽孢杆菌L₁-9(Paenibacillus polymyxa isolate L₁-9)(论文中称之为L₁-9菌株)以及其分离培养方法与抗菌用途。

本发明是以上述来自海洋的多粘类芽孢杆菌L₁-9(Paenibacilluspolymyxa isolate L₁-9)菌株为基础，研究其产中性蛋白酶的方法及其所产的中性蛋白酶。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种来自海洋的多粘类芽孢杆菌L₁-9(Paenibacillus polymyxa isolate L₁-9)产中性蛋白酶方法，其特点是，其步骤如下：

(1)菌株活化：在超净台无菌操作条件下，取多粘类芽孢杆菌L₁-9(Paenibacillus polymyxa isolate L₁-9)菌株，划线接种到PDA斜面培养基上25℃下恒温培养24h；所述的PDA斜面培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，海水1000ml；

(2)种子液的制备：在无菌条件下将5ml PD液体培养基加入到步骤(1)所述活化好的多粘类芽孢杆菌L₁-9(Paenibacillus polymyxa isolate L₁-9)PDA斜面上，冲洗下菌苔并倒入装有45mlPD液体培养基的250ml三角瓶中，25℃，190r/min的条件，振荡培养24h，得种子液；所述的PD液体培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，海水1000ml；