[发明专利]三疣梭子蟹抗菌肽基因及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)中克隆的I型Crustin抗菌肽基因，属生物技术领域。

背景技术

中国是全球最大的水产养殖大国，水产品总产量(捕捞+养殖)占全球35％，其中水产品养殖产量约占全球的70％，2005年水产品产量达5181万吨。其中海水产品2854万吨，占总产量的55％，捕捞约1022万吨，人工养殖产品约1888万吨。随着全球对水产品的消费逐年增加，国内消费增长势头迅猛，另一方面全球海洋捕捞资源衰退，供给逐步转向以养殖水产品为主，中国水产养殖业在全球消费中越来越重要。人工养殖比例逐年提高，1978年人工养殖比例占26％，2005年人工养殖比例达61％。随着水产养殖业的蓬勃发展，由于高密度养殖、养殖水域富营养化、生态环境恶化等原因使得水产养殖品种频频发生各种疾病，经济损失严重，已成为21世纪水产养殖业发展的重要制约因素。据初步统计，目前危害水产养殖生物的病害已达400～500种，大多数病害是由病毒、细菌、真菌等微生物所引起的。而传统的抗微生物药物及饲料添加剂——抗生素，由于耐药性病原菌的形成，以及食品安全性等公共卫生上问题的提出，目前在世界各国养殖业中的使用都受到严格限制，如欧盟自2006年1月1日起，全面禁止食品动物使用抗生素促生长饲料添加剂，因此寻找安全的抗生素替代物、开发安全高效的新型抗微生物免疫增强剂或能增强养殖品种机体免疫力的饲料添加剂成为研究的热点，也是我国养殖业、饲料行业健康、持续发展首要解决的课题之一。

近年来，随着对养殖动物的自身免疫机制的深入研究，发现动物体液中富含多种体液免疫因子如凝集素、防御素、抗菌肽及多种行使调控作用的蛋白因子等。养殖品种自身来源的体液免疫因子由于其特殊的作用机制，不存在食品安全问题与环境问题，并对养殖品种具有促生长、增强免疫力的功能，还可通过基因工程技术大量发酵生产，不存在药源问题，成为替代传统抗生素作为绿色饲料添加剂及抗感染药剂的理想选择，是当前饲料添加剂领域的研究热点。Crustins最早由Relf等在青蟹(Carcinus maenas)中分离鉴定，后续研究表明Crustins普遍存在于甲壳类(蟹、对虾、龙虾、螯虾等)中，主要由甲壳类血淋巴细胞合成，分子量7～14kDa，等电点pI7.0～8.7。甲壳类Crustins以其C末端的WAP(whey acidic protein)结构域为标志，与甲壳类中发现的其它富含Cys的抗菌肽区分开来，如同样富含Cys但不含WAP结构域的甲壳类抗菌肽defensins、penaeidins等。WAP结构域是由8个保守的Cys位点形成四个二硫键，构成一个紧密结构，这种结构又被称作4DSC结构(four-disulphide core)。含有WAP结构域的蛋白广泛存在于其它生物类群中，如哺乳动物的antileukoproteinases、elafins、trappins等，这些含WAP结构域蛋白一般都是小分子分泌蛋白，具有蛋白酶抑制剂、个体生长调节、组织分化调节等生理功能。目前发现的Crustins均由信号肽和成熟肽两部分组成，信号肽区域长16～24Aa，与其它类型抗菌肽如cathelicidins、defensins的保守性相比，Crustins信号肽保守性较差，而成熟肽区域相对保守些。根据信号肽与成熟肽C末端之间结构的差别，可将Crustins分为三个亚型：

I型：信号肽与WAP之间存在一个序列长度多变、富含Cys的结构域，但结构域中Cys的数量不超过6个，因此仅能形成一个4DSC类似结构域，而不能形成完整的4DSC结构域，该区域的一致框架一般为：—C—X(3)—C—X(8—12)—C—C—X(16—17)—C—X(6)—C—X(9—10)—。I型Crustins主要存在于蟹、龙虾和螯虾中。

II型：II型Crustins主要发现于对虾中，不仅有一个富含Cys结构域，而且邻近信号肽区还有一个大约40～80Aa的Gly富集区。Gly富集区在不同种中Gly数量变化较大，一般在20～50个之间，在对虾中一般以5～8个VGGGLG重复结构出现，但在Penaeus monodon中发现的一个Type II crustin(EF523614)中，其Gly富集区的22个Gly残基不是以VGGGLG重复结构出现的。