[发明专利]细菌铜抗性基因,含其的重组载体和其制备和表达

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地，涉及沙雷氏菌编码铜抗性的基因，DNA序列和推导的氨基酸序列，以及抗性蛋白的异源表达，涉及含有该基因的重组质粒和表达该抗性基因的重组菌株，以及它们的制备和表达方法。

背景技术

虽然重金属自然地出现在某些生态系统中，但其工业应用引起许多严重的环境问题，因此重金属对环境的污染和治理日益受到重视，而金属抗性细菌的有效利用则可以从污染的环境中去除金属。因此对于重金属抗性调控的理解，将有助于处理生物废弃物和评估工业活动对自然生态系统的影响。

铜是一种重要的微量金属，在细胞的生理中扮演重要的角色，它也是呼吸作用中一系列酶的重要辅基。但是，超过一定浓度时则对细胞具有毒性，高浓度的铜离子主要通过产生高活性的自由基损伤DNA、破坏膜结构及使酶失活。因此，为了保护细胞免受高浓度重金属毒害，细菌利用一系列抗性机制：如渗透屏障、胞内及胞外多价螯合、外流泵、酶脱毒和还原系统保护自身免受铜的毒害，并确保满足其营养要求。

克隆抗性基因是对重金属抗性机理研究的前提，同时，对克隆到的抗性基因进行改造，不仅可以为探讨细菌重金属抗性机理提供一定的理论依据，还可以为重金属污染地域的生物修复技术的开发和应用提供理论研究和应用基础。

发明内容

本发明旨在提供一种铜抗性基因和该基因的DNA序列和推导的氨基酸(图1)，以及铜抗性蛋白的异源表达(图2)。

本发明的另一目的在于提供一种铜抗性基因的重组表达质粒和重组菌株。

含有上述DNA序列的重组质粒pUC118-Cu1和pET28a-Cu1，以及利用载体pET28a-Cu1转化的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-Cu1。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

铜抗性基因，它的DNA序列如附图1所示。

铜抗性基因，它的氨基酸序列如附图1所示。

所述的铜抗性基因，其由雷氏菌属(Serratia sp.)KMR-3菌株产生，基因序列全长1,117bp，推导的抗铜蛋白由194个氨基酸编码，为CutF蛋白，分子量为约22KDa，理论pI值为5.30；与莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)ATCC 43969铜抗性脂蛋白NlpE同源性最高，达70％。

包括权利要求1的DNA序列的重组载体pUC118-Cu1。

包括权利要求1的DNA序列的重组载体pET28a-Cu1。

利用重组载体pET28a-Cu1转化的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-Cu1。

上述的铜抗性基因、重组载体、重组菌株的制备方法，提取粘质沙雷氏菌KMR-3菌株的染色体DNA，用限制性内切酶Sau3A I进行部分酶切，胶回收酶切产物，并与pUC118 BamH I/BAP载体连接，连接产物经乙醇沉淀，电转化E.coliDH5，涂布含氨苄青霉素的LB平板，成功构建基因组DNA文库；在含有氨苄青霉素和铜离子的选择性平板上筛选重组子，从重组质粒pUC118-Cu1中分离出含铜抗性基因的DNA片段，经限制性内切酶酶切，获得如图1所示的DNA；设计引物扩增铜抗性基因，与pET28a载体连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组质粒pET28a-Cu1和含重组表达质粒的重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-Cu1。

本发明利用从昆明冶炼厂周围废水中分离到的一株对铜离子具有高抗性的沙雷氏菌属(Serratia sp.)KMR-3菌株，其保藏号为：CGMCC No.2636。通过在大肠杆菌DH5中构建该菌的基因组DNA文库，克隆到了与铜抗性相关的基因。克隆到的铜抗性基因所编码的蛋白属于CutF蛋白，由194个氨基酸编码，与莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)ATCC 43969铜抗性脂蛋白NlpE同源性最高，达到70％。通过常规方法获得含有铜抗性基因的重组质粒，转化大肠杆菌菌株成功表达了编码铜抗性基因的蛋白。

此外，通过分子生物学手段，可将本发明涉及的铜抗性基因克隆到其他应用于污水处理的菌株中去，从而提高其对铜的耐受性进而达到富集、转化等去除重金属离子的目的。

本发明涉及的沙雷氏菌属(Serratia sp.)KMR-3菌株已经于2008年8月26日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(中国北京)保藏，保藏号为：CGMCC No.2636。