[发明专利]拟南芥细胞质型谷氨酰胺合成酶基因的植物表达载体的构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种拟南芥细胞质型谷氨酰胺合成酶基因GS1的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-GS1，其构建方法和应用。

背景技术

氮是植物生长的主要的限制性营养元素，由于耕作土壤中的氮素通常很难满足作物对氮元素的需求，因此人们常通过对土壤施用大量的氮肥来满足作物生长的需要。氮肥通常是在高温高压条件下生产的，需要消耗大量的能源，而施用的化学肥料氮只有30％左右被农作物吸收利用，其余大部分进入地下水，造成氮素的损失，同时导致水体和环境污染，长期施用化肥还造成土壤板结等，严重影响到农业的可持续生产。Clark等(Clark RB，Duncan RR.1991.Improvement of plant mineralnutrition through breeding.Field Crop Res.27：219-24)指出：人类在通过施用化肥改变土壤环境满足植物需要方面取得了巨大成绩，但这种途径并不是最实用和经济的办法，可以运用遗传学方法提高植物对土壤环境逆境的适应性。因此通过植物基因工程的方法，提高植物本身的氮素同化能力，是一种最自然、最科学、最环保的方式。

植物通常通过两种途径获取所需氮元素：从土壤中吸收硝酸盐并将其还原为氨，豆科植物也可通过生物固氮的方式从大气中吸收氮气并将其还原为氨。由硝酸盐和氮气还原产生的氨经GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)循环被植物同化。GS在有ATP供能的前提下催化Glu结合NH₃生成Gln，GOGAT将Gln的氨基基团转移给α-酮戊二酸从而生成两分子的Glu(Ireland RJ，Lea PJ.1999.The enzymesof glutamine，glutamate，asparagine，and aspartate metabolism.In BK Singh，ed，Plant Amino Acids，Biochemistry and Biotechnology.Marcel Dekker，NewYork，pp 49-109)。

植物的GS是由八个亚基构成的聚体，其分子量在320-380kD之间(Stewart GR，Mann AF，Fentem PA.1980.Enzymes of glutamate formation：glutamatedehydrogenase，glutamine synthetase and glutamate synthase.In BJ Miflin，ed，The Biochemistry of Plants，Vol.5，Academic Press，New York，pp 271-327)。进一步的生化研究表明在植物中存在不同的GS的同工酶，分别定位在叶绿体(GS2)和细胞质(GS1)中(Hirel B，Gadal P.1980.Glutamine synthetase in rice.PlantPhysiol.66：619-623)。在迄今研究到的高等植物中，GS2由单一的核基因编码并且是叶片中起主要作用的GS同工酶，而GS1则是由一个基因家族的多个同源基因编码的，并且多种植物的GS1基因已经被成功地克隆出来(Tischer et al.，1986；Gebhardt et al.，1986；Tingey et al.，1987，1988；Bennett et al.，1989；Boron and Legocki，1993；Roche et al.，1993；Marsolier et al.，1995；Temple et al.，1995)。GS1在植物叶片中的表达量较低，而在韧皮部则具有较高水平的表达。这些GS同工酶的组织特异性和亚细胞水平的特异性表达说明它们的功能是不相重叠的(Tingey SV，Tsai F-Y，Edwards JW，Walker EL，Coruzzi GM.1988.Chloroplast and cytosolic glutamine synthetase are encoded by homologousnuclear genes which are differentially expressed in vivo.J Biol Chem.263：9651-9657；Oliveira IC，Coruzzi G.1999.Carbon and amino acids reciprocallymodulate the expression of glutamine synthetase in Arabidopsis thaliana.Plant Physiol.121：301-309)。在植物的光呼吸过程中，氨在线粒体中被释放，释放的总量可能超过同期初级氮同化作用所吸收的氨的十倍，释放的氨进入叶绿体中由GS2进行再同化。由于光呼吸释放出的氨有一个从线粒体出来通过细胞质再进入叶绿体的过程，在这个过程中，会有一部分氨滞留在细胞质中，因此通过基因工程的方法在过量表达细胞质型GS基因有可能提高转基因植物的氨的再同化效率。Hirel等人(1992，1997)将来自大豆GS1基因与CaMV 35S启动子融合起来并转入烟草中，观察到转基因植株叶片的叶肉细胞中自身的GS1基因的表达受到相应的诱导，但是在正常的生长条件下转基因植株的生长状况以及叶片中GS1活性与对照植株相比没有明显变化。Fernando Gallardo等人(1999)在白杨中过量表达了来自松树的胞质型GS并使其表达受到CaMV 35S启动子的调控，这是通过过量表达胞质型GS基因提高树木的氮素利用率的首次尝试。Vincent等人(1997)在百脉根中以CaMV 35S启动子调控来自大豆的胞质型GS的过量表达，发现胞质型GS的上调表达会促进植物的生长和发育，导致植物较早的开花并促进植物的衰老。Fuentes等(2001)在烟草过量表达了来自紫花苜蓿的GS1基因，同样以CaMV 35S启动子调控其表达，发现转基因株系叶片的GS活性比对照植株高6倍，光合能力得到明显增强，并且在低氮条件下显示出优于对照植株的生长能力，表现在其茎的伸长、根的干重以及叶片面积均远远超出对照植株。近年来也有学者试图通过过量表达多个GS基因以提高氮素同化能力。例如，Sun等人(2005)利用RT-PCR技术克隆出大豆的GS1和GS2的cDNA并将两个基因共同连入p2GS双元植物表达载体并转入水稻中，使得GS1基因和GS2基因的表达分别受到Act1启动子和Ubi启动子的调控，结果说明转基因植株对低氮条件的耐受力明显优于对照植株。这些实验数据提供了大量证据表明GS的过量表达将影响植物的光合速率，提高植物对低氮胁迫的耐受力，也证明了通过基因工程技术提高植物的氮素利用率的方法是可行的。但至今尚未有含有拟南芥基因组中存在的细胞质型的GS1基因的植物表达载体的相关报道。