[发明专利]家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因及用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕的具有抗农药或抗氧化活性的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因。

背景技术

农药在害虫防治中起着非常重要的作用，但是随着大量农药的使用，昆虫抗药性日益加剧，迫使人们开发新的农药产品或加大药剂的用量，这不但制约了经济的发展，也给环境带来了严重的负担，影响到了经济和人类的可持续性发展。加之，昆虫抗农药与昆虫的抗氧化往往联系在一起，例如：昆虫在解毒代谢有机磷农药过程中，可能会产生一些活性氧等物质，从而诱导昆虫的氧化应激反应，因此昆虫在提高农药抗性的同时，抗氧化的能力也在随之增加。

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-transferase，GSTs，EC 2.5.1.18)是一类重要的同工酶超家族，广泛分布在动物、植物、酵母、细菌等生物体中，具有消除内源和外源性有毒物质的功能。在昆虫体内它不但行使对多种有机合成农药的代谢外，而且也具有消除昆虫体内多余的自由基，保持体内的氧化与抗氧化的动态平衡。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，对家蚕GST基因进行克隆，以及对其功能进行研究，为阐明GSTs与杀虫剂抗性的关系，以及为农林害虫的防治有着重要的理论和实践意义。到目前为止，尚无有关家蚕的具有抗农药或抗氧化活性的基因的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自于家蚕的具有抗农药或抗氧化活性的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因，通过对该基因更进一步的研究，可为研制防治鳞翅目害虫药物提供理论基础。

本发明申请人利用鳞翅目害虫小菜蛾有机磷抗性基因PxGST3(accession numberU66342)(Huang HS，Hu NT，Yao YE，et al.Molecular cloning and heterologus expression of aglutathione S-transferase involved in insecticide resistance from the diamondback moth Plutellaxylostella.Insect Biochemistry and Molecular Biology，1998，28：651-658)蛋白质序列，在家蚕基因组中进行TBLASTN检索，获得了多个谷胱甘肽-S-转移酶同源基因，对比对得最好的家蚕BmGSTe7基因进行了克隆、表达、纯化以及酶活性的测定。具体方法如下：

(1)首先以家蚕基因组中预测的编码区序列(coding sequence，CDS)，在家蚕表达序列标签(expressed sequence tag，EST)数据库中为BmGSTe7基因寻找EST证据，找到了2条EST序列，以CDS和EST序列为此基因设计特异性引物；BmGSTe7的正向引物：5’CATATGAGTCTAATGTTGTACAAACTA 3’，反向引物：5’GGATCCTACATTTTATAGATTAAGATCCA3’；正向引物和反向引物中分别加有NdeI和BamHI酶切位点；

(2)以设计的特异性引物在家蚕5龄3的脂肪体cDNA为模板进行扩增，获得了目的条带，PCR产物回收后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海Sangon测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致；

(3)将含有目的片断的T克隆与pET28a空质粒分别用NdeI和BamHI进行双酶切，分别回收目的片断，以T4连接酶将其连接并转化Bl21(DE3)感受态细胞，筛选获得含有pET28a-BmGSTe7的克隆，提取质粒并送往上海Sangon测序，获得正确的克隆；将含有pET28a-BmGSTe7重组质粒的单克隆在含有卡那的LB培养基中37℃振荡培养，至OD₆₀₀＝0.6左右，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，继续诱导培养5小时，取50ml菌液10000g离心5分钟收集菌体沉淀，以His标签纯化目的蛋白质，纯化方法按照pET宝典进行；目的蛋白对模式底物CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)的活性为15μmol/min/mgprotein；

(4)序列同源性分析：相似性比较在NCBI站点上用BLAST完成，BLAST分析表明，BmGSTe7与昆虫特异的Epsilon家族成员相似性较高；在家蚕基因组中BmGSTe7也是与鳞翅目害虫小菜蛾PxGST3基因比对得最好，其蛋白质序列的一致性为53％，而且BmGSTe7与模式底物CDNB有较高的活性，说明BmGSTe7为抗药性相关的重要基因。