[发明专利]基于模拟人血管内皮细胞生长因子VEGF表位的疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种人血管内皮细胞生长因子VEGF的模拟表位，其特征在于：利用噬菌体随机呈现技术筛选出与人鼠嵌合单克隆抗体阿瓦斯汀(Avastin)特异亲和的VEGF模拟表位，其氨基酸序列为：

Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。

2.一种人血管内皮细胞生长因子VEGF模拟表位的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行：

a)噬菌体随机呈现十二肽库的筛选

首先菌体滴度的测定：

噬菌体随机呈现十二肽库Ph.D.-12^TM的噬菌体感染宿主后，加入20mg/mL的X-gal和50mg/mL的IPTG孵育过夜；观察平板，计数蓝色噬斑并乘以该平板中噬菌体样品的稀释倍数，得到每10μl Ph.D.-12^TM噬菌体的滴度，以蓝色噬斑形成单位表示(plaque forming units，pfu)；

其次生物淘洗：

(1)接种噬菌体宿主细菌于含四环素的LB培养液中，37℃培养；

(2)以0.1mol/L的NaHCO₃为溶剂配制pH为8.6、Avastin的浓度为100μg/mL的Avastin溶液，将Avastin溶液包被ELISA板孔过夜；将过夜后的96孔板倒扣在洁净的纸巾上，除尽残余液体，然后用含质量分数为1％BSA的TBS溶液4℃孵育2h；再采用质量分数为0.1％的Tween 20的TBST洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，除尽残余液体；所述TBS溶液为50mM的pH值为7.5的Tris-HCl溶液；

(3)加入200μl质量分数为0.1％的Tween 20的TBST稀释的含2x10¹¹pfu的Ph.D.-12^TM噬菌体溶液，室温孵育1h；倾去液体，去除未结合的噬菌体，再用质量分数为0.1％的Tween 20的TBST洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸 巾上，除尽残余液体；用100μL洗脱液洗脱结合的噬菌体，并加入15ml中和液；取1μL测滴度，剩余液体加入20mL处于对数生长早期的宿主培养物中，于37℃剧烈振荡培养4.5h，得到扩增的噬菌体；所述的洗脱液为含0.2mol/L的Glycine-HCl和pH值为2.2的10g/L的BSA的混合溶液；所述的中和液为pH值为9.1的1mol/L的Tris-HCl溶液；

(4)将扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液转入离心管，4℃条件下离心10000rpm×10min；上清液转入离心管，4℃条件下10000rpm×10min再离心一次；取80％的上清液转入离心管，加入3ml的PEG8000/NaCl溶液4℃静置过夜；次日，4℃离心10000rpm×15min，倾去离心上清液；用1mL的TBS重悬沉淀，于4℃离心10000rpm×5min，沉淀残留的细胞；上清加入150ul的PEG-8000/NaCl冰浴1h，4℃离心10000rpm×15min，倾去上清，用200μL含质量分数为0.01％的NaN₃的TBS重悬沉淀，离心10000rpm×1min；上清液即为扩增好的Ph.D.-12^TM噬菌体噬菌体洗脱液，1μL用于测滴度，余下的液体于4℃存放；所述的PEG8000/NaCl溶液含200mg/mL的PEG-8000和2.5M的NaCl；

(5)按照上述第(2)步再包被ELISA板，进行第二、三轮筛选；第二轮、第三轮筛选中Avastin浓度分别降至为50μg/mL、20μg/mL，分别加入2x10¹¹pfu在第一轮、二轮筛选出的扩增好的Ph.D.-12^TM噬菌体，操作步骤按上述筛选步骤(1)-(4)进行；TBST的Tween20浓度均提高至0.5％；第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取1ul测定滴度；

(6)从第三次筛选后噬菌体滴度测定中，菌斑数＜100的平板上随机挑取80个分隔良好噬菌斑进行扩增和纯化，挑取的噬菌斑培养的时间不超过18h；所述的扩增和纯化：用无菌牙签蘸取的80个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入对数中期培养的宿主培养物中，37℃剧烈振荡培养4.5h后，12000rpm离心30s，将上清液 转入新的离心管，12000rpm再离心30s，取80％的上清，即得扩增的噬菌体悬浮液；

b)特异性噬菌体筛选

在上述选出的80个克隆中利用噬菌体ELISA进一步挑选与Avastin高亲和力的克隆；

(1)以100mg/L的Avastin包被96孔酶联板，每孔200μL，同时对每个Avastin孔设立白介素15(IL-15)单抗为阴性对照，4℃孵育过夜；

(2)倾去包被液，加入封闭液4℃封闭2h；倾去封闭液，TBST清洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，除尽残余液体；将80个纯化的噬菌体按1×10⁹/孔分别加入Avastin、IL-15单抗包被孔中室温孵育2h；所述的封闭液含5mg/L的BSA和0.1mol/L的NaHCO₃的混合溶液，该封闭液的pH为8.6；

(3)TBST清洗6次，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的1∶5000的小鼠抗M13噬菌体抗体100μL，室温孵育1h；TBST清洗6次，邻苯二胺(O-Phenylenediamine)显色后测定A490nm处的吸光值；

(4)根据A490nm处的吸光值，筛选出42个与Avastin有较高亲和力而与其他对照亲和力低的克隆进行序列测定；筛选方法：噬菌体与Avastin结合后A490nm吸光值大于0.5，同时与对照组A490nm吸光值的比大于3；

c)噬菌体呈现肽的序列测定

(1)噬菌体单链DNA的提取：

噬菌体克隆的扩增后，取噬菌体培养上清，用单链DNA提取试剂盒进行噬菌体单链DNA的提取，紫外定量其浓度大于100ng/μL；

(2)Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列：

以噬菌体单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序列为ccctc atagt tagcg taacg，在DNA自动测序仪上进行自动测序； 

(3)呈现随机肽氨基酸序列的推导：

根据DNA测序结果，得出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，得出序列如下：Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。