[发明专利]重组胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及目的蛋白质的重组质粒的构建、原核表达、纯化及鉴定，特别涉及胸腺素β4(Tβ4)二串体蛋白及其制备方法。 

背景技术

1、胸腺素β4的生物化学特性 

1.1胸腺素β家族 

胸腺素主要是由胸腺产生，最初由Goldstein自胎牛胸腺蛋白提取液中制备得到，含40多种多肽成分，根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位置，划分为α、β、γ三个区：α区pI＜5，β区pI在5～7之间，γ区pI＞7，其中位于β区的多肽被称为β族胸腺素，其结构高度保守，由40～44个氨基酸组成，相对分子质量约为5000Da。至今，已发现的β族胸腺素有15种，人体内存在3种，即胸腺素β4、胸腺素β9和胸腺素β15，其氨基酸序列具有高度同源性，在维持肌动蛋白的动态平衡以及肿瘤发生与转移、细胞凋亡、炎症、血管生成和创伤愈合等很多生理、病理过程中发挥重要作用。 

1.2胸腺素β4的化学结构 

胸腺素β4是由43个氨基酸残基组成的多肽，分子量4963Da，等电点PI为5.1，在哺乳动物中高度保守。与胸腺素α原或类胸腺素不同，胸腺素β4是胞浆蛋白而非核蛋白，并且它只含有较少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys结构区域。其氨基酸序列如下：AcSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES。 

化学构象研究表明，胸腺素β4是以单链形式存在及发挥作用，其第18～ 30残基和第31～43残基间是一内部重复区域，有6个氨基酸相同。虽然存在第5～6残基和第31～40残基两个α螺旋，但是胸腺素β4没有β转角形成。 

1.3胸腺素β4的生物学分布 

因为胸腺素β4首先是从胸腺中分离纯化得到的，因此最早人们认为它是一种胸腺激素作用于T细胞成熟早期，但是胸腺素β4又广泛存在于其他组织、器官和细胞中，其中含量最高的分别是脾脏、胸腺、肺和腹膜巨噬细胞，其次是脑、肝、肾脏、睾丸、心脏，甚至非网状内皮系统的细胞如成肌细胞、成纤维细胞等也能合成Tβ4。胸腺细胞中胸腺素β4 mRNA含量高于胸腺基质细胞7倍，并且各型血细胞中均有胸腺素β4表达。 

2、胸腺素β4的生理功能研究进展 

2.1胸腺素β4与免疫学功能 

胸腺素β4不但在胸腺依赖性淋巴细胞的调节与分化方面具有重要功能，可显著增强胸腺细胞、骨髓细胞末端核苷酰转移酶活性，还可刺激下丘脑促黄体激素释放激素以及黄体激素的分泌，诱导T细胞系分型转变，在CD4细胞增殖抑制时激活CD8细胞；胸腺素β4与祖B细胞共培养降低Fcα受体的表达，具有抗体依赖细胞的细胞毒活性；HIV-1感染的T细胞、巨噬细胞中胸腺素β4翻译量降低2～3倍，AIDS病人淋巴细胞中胸腺素β4 mRNA量减少5倍。这些研究结果表明，胸腺素β4在宿主防御过程中发挥基础作用。 

2.2胸腺素β4与神经系统发育 

研究发现胸腺素β4在脑发育中显示复杂的表达模式，尽管在体内未成熟的粒细胞表达较高，当粒细胞分化后便减弱至消失，但在星形神经胶质细胞及小神经胶质细胞中一直高水平表达；原位杂交表明，胸腺素β4在中枢神经系统及外周神经节中与神经分化同步高效表达；研究斑纹鱼胚胎发育过程发现，胸腺素β4 mRNA在神经和脑分化时丰度增加，注射反义RNA到斑纹 鱼胚胎，导致脑发育缺陷和视神经系统发育障碍。 

2.3胸腺素β4与造血干细胞 

使用乙酰胆碱酯酶竞争酶联免疫跟踪胸腺素β4及其N端AcSDKP序列表明，二者是造血干细胞增殖的负调控因子，抑制人骨髓干/祖细胞生长，降低S期细胞百分率，在细胞因子存在时降低CD34⁺细胞的增殖率，可保护造血干细胞免于过度分化。AcSDKP序列是胸腺素β4和TNFα的共享序列，促进5-FU处理后小鼠HPP-CFC、BFU-E、CFU-GM的恢复，可能具有保护造血细胞抵抗化疗药物杀伤的作用。 

2.4胸腺素β4与肌动蛋白 

1991年Safer等从人血小板分离到G-肌动蛋白结合蛋白胸腺素β4，能调节肌动蛋白聚合的动力学变化，抑制肌动蛋白的聚合。研究胸腺素β4与肌动蛋白的相互关系发现，胸腺素β4与肌动蛋白结合比例为1∶1，其α螺旋是相互结合的必需结构。胸腺素β4对肌动蛋白聚合的调控作用影响了细胞的粘附、运动、分裂、增殖等活动，还可能参与了肿瘤的转移。 

2.5胸腺素β4与炎症反应