[发明专利]胃癌多药耐药性鉴别诊断用CIAPIN1单克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域和医疗检测试剂技术领域，是临床上胃癌病理鉴别诊断中对多药耐药性胃癌进行确认的一种新的标志物——鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。尽管其发病率一直处于下降趋势，但在亚洲国家如中国、朝鲜和日本以及一些欧洲和南美洲国家，胃癌的发病率依然很高。化疗是胃癌的主要治疗手段之一，虽然人们使用了多种化疗药物，但胃癌的治疗仍未得到根本改观，其原因主要是胃癌可产生对化疗药物的耐受性。耐药性尤其是多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是恶性肿瘤化学治疗成功的主要障碍之一。具有多药耐药性的肿瘤细胞同时耐受多种在结构和作用机理上完全不同的化疗药物。耐药性可以分为自发性或内在性(intrinsic)耐药和获得性(acquired)耐药两类，前者是指肿瘤细胞在未接触化疗药物时即具有耐药性，而后者是指肿瘤细胞在接触化疗药物后产生的耐药性。通常认为，MDR的产生是由细胞膜系结构上能量依赖性的转运分子介导的，这些分子能将药物泵出细胞或某种亚细胞器外，使药物不能到达其作用靶点。这些转运分子包括P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP-1)、肺耐药相关蛋白(lung resistanceprotein，LRP)和乳腺癌耐药相关蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP/MXR/ABCG2)。另外，包括谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)介导的细胞解毒系统功能增强和细胞对化疗药物诱导的凋亡的敏感性下降也参与了某些恶性肿瘤MDR的发生。

胃癌发生MDR的机制远未阐明。本研究所对100例未经治疗的胃癌组织标本内MDR相关分子的检测显示，GST-pi mRNA、MRP mRNA、LRP mRNA、P-gp mRNA和MGr1-Ag蛋白的阳性率仅分别为36.0％、12.0％、10.0％、10.0％和18.0％，总阳性率为58.0％。这一结果表明虽然胃癌发生MDR是一个普遍的现象，但经典的MDR介导分子的表达并不如预想的那样高，提示胃癌MDR的产生有着复杂的机制，其中可能涉及一些非经典的MDR相关分子，需要我们进一步寻找和验证。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种CIAPIN1单克隆抗体及制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种CIAPIN1的纯化蛋白。

本发明的第三个目的是提供制备CIAPIN1单克隆抗体的两种载体。

本发明的第四个目的是提供制备CIAPIN1单克隆抗体的两种宿主菌。

本发明的第五个目的是提供CIAPIN1单克隆抗体在临床胃癌患者胃癌多药耐药性鉴别诊断中的应用。

本发明鼠抗人CIAPIN1单克隆抗体的制备方法如下：

1.RT-PCR方法克隆CIAPIN1基因

1.1引物设计：

正向引物：5′-CGGAATTCATGGCAGATTTTGGGATCTC-3′

反向引物：5′-GGTCGACCTAGGCATCAAGATTGCTATC-3′

正向引物引入EcoR I酶切位点，反向引物引入Sal I酶切位点(下划线部分)便于亚克隆操作。引物由上海生工合成。

1.2逆转录合成单链DNA(Invitrogen公司的Superscript逆转录试剂盒)：

反应按如下条件进行：人胃癌多药耐药细胞SGC-7901/VCR总RNA(按Invitrogen公司TrizolRNA纯化试剂盒操作，制备)(1μg/μl)2μl，随即六核苷酸引物(10μmol/L)7μl，脱氧核糖核酸dNTPs(10mmol/L)1μl，焦碳酸乙二酯(DEPC)处理水2μl，5×第一链合成缓冲液4μl，二流苏糖醇(DTT，0.1mol/L)2μl，RNA酶抑制剂RNasinlμl，RNA依赖DNA合成酶Superscript II，总反应体积为20μl，42℃水裕50分钟，70℃灭活15分钟，将所得的逆转录产物置-20℃保存备用。

1.3以上逆转录产物为模版，PCR扩增CIAPIN1基因cDNA

反应体系如下：

逆转录产物          1μg(1μl)