[发明专利]丝氨酸蛋白酶抑制物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及丝氨酸蛋白酶抑制物的长效重组，且涉及其制备方法。

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制物(TFPI)，分子量约40kd，前体有304个氨基酸，成熟蛋白则有276个氨基酸，后者由氨基末端、三个串联的Kunitz型结构域和梭基末端组成，动物和人体实验证实TFPI能有效治疗严重感染、浓毒血症、弥漫性血管内凝血(DIC)、多脏器功能衰竭(MOF)、高凝状态、血栓栓塞性疾病和肿瘤等具有良好疗效，是一种具有良好应用前景的蛋白质。大多数TFPI由血管内皮细胞合成和分泌，平滑肌细胞、心肌细胞和纤维母细胞在一定条件下也可产生TFPI。无论是人体自身的TFPI，还是给予的重组野生型TFPI，它的半衰期都很短，只有2分钟左右，会很快从血液中清除。TFPI进入血液循环后，迅速与肝细胞膜上的LRP结合，然后被降解和代谢。半衰期短是TFPI在发挥治疗作用时最大的缺点，必须连续72一96小时给药才能保持疗效，每个疗程约需160一犯omg，如此大的剂量给病人带来了巨大的经济负担。因此，延长TFPI的半衰期，减少其用药量，是急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供半衰期长，具有良好抗凝功能的丝氨酸蛋白酶抑制物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明首先在计算机工作站上模建了TFPI和LRP分子，然后将两者进行对接，发现TFPI梭基末端的某些关键氨基酸在TFPI和LRP的相互作用发挥关键作用。本发明将TFPI梭基末端267一304区域内的某些氨基酸进行不同程度的替代和缺失突变后，两者的结合能力出现了不同程度的下降，所述LTFPI的半衰期较TFPI延长10倍以上，并具备抗组织因子、凝血因子V工工/Vlla和凝血因子X/Xa功能。其中将269、252、288和289位赖氨酸全部替换为丙氨酸的突变效果为佳。

本发明还提供了制备LTFPI的方法，包括制备至少包含表达生物活性的LTFPI编码序列部分的cDNA，在适合表达的载体中克隆CDNA片断，用该载体转染宿主细胞，在适于表达该cDNA片断的条件下培养该宿主细胞，以及从培养物中回收和纯化所需LTFPI。

本发明中LTFPI基因的制备包括经过点突变后的基因，与相关质粒重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核普酸序列分析验证基因是否正确。将本发明的LTFPI CDNA片断与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达质粒，包括真核表达载体pP工CgK或原核表达载体pET28或pLY一4。

本发明使用pET28原核表达载体，上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞，包括原核表达宿主细胞是BLZI或JFll25和真核表达宿主细胞GSll5。本发明使用大肠杆菌BLZI作为特定的宿主细胞，本发明的表达产物以包涵体形式存在于宿主细胞的胞体中，破菌分离包涵体，高浓度尿素或盐酸肌溶解包涵体，分离纯化LTFPI，经适当复性后即获得有活性的LTFP。

以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照<分子克隆实验指南>。

本发明的有益效果

本发明应用基因工程方法对LTFPI进行生产，所得产品具有高效的抗凝、抗血小板和抗炎功能，与野生TFPI性质比较表明，LTFPI半衰期明显延长，其余功能类似。LT即工为注射剂和非注射剂研究提供了原料，可用于预防和治疗严重感染性疾病和血栓栓塞性疾病等。

具体实施方式

实施例1

(1)TFPI和LRP在计算机工作站上的对接与分析

应用InsightH软件，在计算机工作站上对TFPI和L即进行对接，寻找到了TFP工梭基末端269、282、288和289位赖氨酸是两者相互作用的关键位点。

(2)LTFPI的设计、制备和性质鉴定

将TFPI梭基末端269、282、288和289位赖氨酸替换为丙氨酸。序列使用PCR点突变获得基因，与pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核普酸序列分析证实基因序列正确。然后将LTFP工基因切出，与原核表达载体pET28重组，构成原核表达质粒rLTFP工一pET28。转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片断，证实获得阳性克隆。

实施例2

LTFP工基因获取方法如下：