[发明专利]鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专用试剂盒。

背景技术

结核病(Tuberculosis)是当今全球范围对人类最具威胁的感染性疾病之一，本 世纪80年代中期以来在全球出现回升趋势，据世界卫生组织报道，我国是全球22 个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。目前我国全年龄组 结核菌感染率为44.5％，全国约5.5亿人受到了结核菌感染，结核菌感染率高于全 球人口感染率为1/3的水平。同时，非结核分枝杆菌(NTM)病也呈逐年上升趋势， 2000年卫生部组织的流调数据显示，NTM菌株分离率上升至11.1％，NTM病临床表 现与结核病相似，在无菌种鉴定结果的情况下，经常被误诊为结核病。大量研究以 及临床治疗病例表明多数传统抗痨药对NTM病很少或没有疗效，传统的菌种鉴定和 药敏试验方法烦琐、费时，延误病人的治疗。因此，结核分枝杆菌与非结核分枝杆 菌区分检测对结核病的早期诊断、鉴别诊断、个体化的有效化疗和控制传播都有极 其重要的意义。

结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的区分目前仍然依靠传统的分离培养的方法， 通常需要1-4周的时间才能得到确切的结果，这样大大的延误了病人的治疗，给病 人造成额外的经济负担和精神负担。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法及其专 用试剂盒。

本发明所提供的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的试剂盒，包括进行PCR 扩增的引物和探针，其中，所述引物包括4条引物，分别为引物1、2、3和4，所 述引物1和引物2能与结核分枝杆菌的特异片段结合，所述引物3和引物4能与分 枝杆菌特异片段结合；所述探针包括2条，分别为探针1和探针2，所述探针1能 与结核分枝杆菌特异片段结合，并且其结合位置位于所述引物1和引物2与结核分 枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针2能与分枝杆菌特异片段结合，并且其结 合位置位于所述引物3和引物4与分枝杆菌特异片段结合位置之间；所述探针1和 所述探针2的5’端带都有荧光物质，3’端都带有淬灭物质，所述探针1和所述探 针2的5’端的荧光物质不同。

所述结核分枝杆菌的特异片段可选自如下：IS6110、16s、IS986、MTP40、38kDa、 IS1081和ESAT-6。所述分枝杆菌特异片段可选自如下：16s、dnaj基因、编码65kDa 蛋白的核苷酸序列、编码38kDa蛋白的核苷酸序列和编码32kDa蛋白的核苷酸序列。

所述引物1的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1，所述引物2的核苷酸序 列具体可为序列表中的序列2，所述引物3的核苷酸序列具体可为序列表中的序列 4，所述引物4的核苷酸序列具体可为序列表中的序列5；所述探针1的核苷酸序列 具体可为序列表中的序列3，所述探针2的核苷酸序列具体可为序列表中的序列6。

所述引物1的核苷酸序列还可为序列表中的序列7，所述引物2的核苷酸序列 还可为序列表中的序列8，所述引物3的核苷酸序列还可为序列表中的序列10，所 述引物4的核苷酸序列还可为序列表中的序列11；所述探针1的核苷酸序列还可为 序列表中的序列9，所述探针2的核苷酸序列还可为序列表中的序列12。

所述荧光物质为FAM、HEX、TET、TAMRA、VIC、CY5、Texas Red或JOE。所述 淬灭物质为TAMRA、Dabcyl或Eclipse。

所述探针合成时，荧光物质和淬灭物质被标记在探针的末端，所用荧光物质和 淬灭物质可进行选择，能提供合成服务的公司有：宝生物工程有限公司、上海生工 生物工程技术服务有限公司、上海基康生物技术有限公司、ABI公司等。

本发明的另一个目的是提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法。

本发明所提供的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

用所述的试剂盒中的引物和探针对待测菌株的核酸进行荧光定量PCR扩增，检 测所得到的PCR产物的荧光信号；如果能检测到探针1的荧光信号，则待测菌为结 核分枝杆菌；如果不能检测到探针1的荧光信号，而能检测到探针2的荧光信号， 则待测菌为非结核分枝杆菌。

所述非结核分枝杆菌为如下表1所示。

表1.非结核分枝杆菌