[发明专利]HPV融合蛋白、基因、载体、菌株、制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体地，本发明涉及一种人乳头瘤病毒 (HPV)16型L2E7融合蛋白、其编码基因、质粒载体、表达菌株、制备方法 及其免疫预防和治疗用途。

背景技术

世界卫生组织统计资料表明，子宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中排列第 二，在一些发展中国家甚至居首位。每年大约有50万新发宫颈癌病例，约 20万人死于宫颈癌^[1-3]，其中80％在发展中国家。我国是宫颈癌高发国之一， 据不完全统计我国宫颈癌年发病率约13.8万人，每年死于宫颈癌的患者约5 万人。已有研究资料证明高危人乳头瘤病毒(HPV)感染和子宫颈癌发生密 切相关，90％以上的宫颈癌以及癌前病变，鳞状上皮病变组织中可检测到 HPV DNA，是宫颈癌的重要致病因子。由于刚在美国上市的HPV预防性疫 苗价格昂贵及伦理问题，目前临床仍无广泛预防HPV感染的措施，而现行 的早期宫颈粘膜涂片筛查可实现宫颈癌的早期发现，能降低癌症死亡率，但 并不能消除HPV感染，且费用高，在不发达国家难以普及。此外，目前对 中晚期宫颈癌的化疗和手术治疗效果仍不理想，复发率较高且花费较大。因 此，研制特异性的免疫治疗方法即疫苗接种的办法预防和治疗HPV的慢性 感染及其所引起的癌前病变成恶性病变是迫在眉睫的任务，如果研究成功其 将成为预防和治疗宫颈癌的重要手段，尤其在发展中国家应更不失为一条经 济有效的途径。

由于HPV在体外难于培养和其致癌性，完整的病毒颗粒不大可能发展 为疫苗，只能研制基因工程疫苗。近十几年来，HPV疫苗研究可以分为两种 类型：预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗一般以HPV16主要衣壳蛋白 L1和次要衣壳蛋白L2为靶抗原作用在于诱发机体产生特异性的中和抗体和 有效的局部免疫反应以阻止建立HPV的长期感染和再感染。HPV的衣壳蛋 白在真核以及原核表达系统中表达时，能自我装配或体外包装折叠成病毒样 颗粒(VLP)，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似^[4-9]。VLP能与 细胞受体结合进入细胞，这样有利于抗原的加工呈递，诱发强的细胞免疫。 治疗性疫苗通常是以经修饰后去除其转化活性但仍保留其抗原性的HPV16 早期蛋白作为靶抗原，诱导特异性的细胞免疫反应用于控制或消除感染HPV 的良性和恶性病灶，可作为该类疾病的手术后辅助治疗。在大多数HPV16 相关宫颈癌及其癌前病变中，HPV16的E6和E7蛋白是持续表达的，而这 种持续表达是肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需的，宫颈癌细胞不可能通 过抗原丢失来逃避免疫监视，并且正常组织中不存在这两种蛋白，因此E6 和E7蛋白成为HPV16相关宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的理想靶抗原。中 晚期癌症病人手术后残留的肿瘤细胞可采用这种治疗性疫苗接种，激发细胞 免疫来杀伤清除这些肿瘤细胞和已感染的上皮细胞，从而防止或限制肿瘤的 复发和扩散。预防性和治疗性这两类疫苗划分不是绝对的，如在良性疣和轻 度CIN病变中存在HPV晚期蛋白的表达，预防性疫苗对这些疾病也有一定 治疗作用，近年研制的一些疫苗，如嵌合性疫苗、HPV假病毒疫苗等同时 具备预防和治疗双重作。有些研究是将HPV衣壳蛋白与早期蛋白融合在一 起，目的是为了同时提供预防和治疗两种效果。

近几年大量的研究资料表明^[9]，L2次要晚期蛋白能诱发中和抗体，而且 具有一定的交叉保护活性。

发明内容

下面详细讨论本发明各种技术方案的制备和使用，但应该理解，本发 明提供了许多适用的发明构思，其可以体现在各种各样的具体方面上。

为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本 发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语可用于说明的具体实 例的一般类别，但它们的使用不限制本发明，权利要求中所概括的除外。

除非另外指出，本文所述的“HPV”是指人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)；

除非另外指出，本文所述的“bp”是指碱基对(base pair)；

除非另外指出，本文所述的“ELISPOT”是指酶联免疫斑点 (Enzyme-linked immunospot)；

除非另外指出，本文所述的“IPTG”是指异丙基硫代-β-D半乳糖苷 (Isopropylthio-β-D-galactoside)；