[发明专利]用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光PCR引物和探针

说明书

技术领域

本发明属于流行病学和食品卫生检测领域，具体而言，本发明 涉及用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光PCR引物和探针，以及 使用其进行检测的方法，更具体地说，是对猪、牛、羊等偶蹄类动 物及相关动物产品中是否携带A、O、C以及Asia1型口蹄疫病毒进 行检测的通用实时荧光PCR引物和探针，以及使用其进行检测的方 法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的 急性、热性、高接触性传染病(江鹏斐等，1999)，同时也是一种 严重的“政治经济病”，列为OIE规定的A类传染病之首，同时也 是动物及动物产品国际贸易中重要的检疫对象(董志强等，2007)。 目前，ELISA及病毒分离是OIE推荐的检测方法，存在操作时间长 (病毒培养需要4d时间)、敏感性低(ELISA敏感性只有70％-80％) 等缺点(花群义等，2005)。

荧光PCR(FQ-PCR)技术是美国PE(Perkin Elmer)公司1995 年研制出来的一种新的核酸定量技术，该方法自产生以来，不断发 展完善，特别是随着TaqMan探针的广泛使用，到目前为止该技术 已经非常成熟，具有灵敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特异 性强(在普通PCR一对引物的基础上，中间还设计有探针，只有引 物和探针均完全配对，才可能得到扩增，可对少至2个核苷酸的序 列差异进行鉴定，从而保证了反应的特异性)、操作安全方便(无须 凝胶电泳，避免了EB染色对人体的危害)等优点，目前已被广泛 应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因 表达、突变及其多态性的研究等多个领域。

目前，国内外建立了很多FMDV通用型荧光RT-PCR检测方法。 但现有资料表明作为RNA病毒，FMDV在复制过程中由于缺乏校对 机制，基因组每复制一次，就有0.1-10个核苷酸发生变异(Gu等， 2007)。在不同的生存环境、免疫压力等条件的诱导下，基因组特别 是结构蛋白编码区核苷酸变异的几率更高，很难选择在蛋白编码区 设计引物/探针，建立通用型荧光RT-PCR检测方法。同时研究表明， FMDV的七个血清型即O、A、C、亚洲1(Asia1)型、南非1、2、 3型(SAT1、SAT2、SAT3)可用核酸杂交分成两群，O、A、C和 亚洲1型为亚欧型FMDV，南非1、2、3型为南非型FMDV，群内 各型核酸同源性达60％-70％，但两群之间仅为25％-40％(卢曾军， 2003)，因此目前还很难设计出特异性较高的亚欧型及南非型均通用 的荧光RT-PCR引物与探针。

针对目前我国尚无南非型口蹄疫疫情的现状，本发明在对 FMDV大量基因信息进行分析比较的基础上，选择亚欧型口蹄疫病 毒高度保守的5′-UTR(非翻译区)设计引物和探针，建立了亚欧型 FMDV特异的荧光RT-PCR检测方法，从而可大大提高口蹄疫病毒 PCR检测方法的通用性，满足我国相关动物及动物产品的口蹄疫检 测及监测需求。

发明内容

本发明目的在于提供用于亚欧型口蹄疫病毒检测的荧光PCR引 物和探针序列。

本发明的目的通过下述技术方案实现：从GenBank中获得口蹄 疫病毒(FMDV)基因组序列，应用MegAlign软件对上述序列进行 比较和一致性分析，选择较为保守的5′-UTR(非翻译区)序列，根 据引物和探针的设计原则，用软件Beacon Designer7.0在这些序列 的保守区域筛选到一对具有通用碱基序列的通用引物，引物对经在 线序列BLAST分析，确定为亚欧型FMDV(包括A、O、C以及 Asia 1型)区别于南非型FMDV(包括SAT-1、SAT-2、SAT-3型) 的特异性引物对。在该引物对的扩增区域内设定一条通用的荧光 TaqMan探针，报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记 在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的 荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱， 报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同DNA模板上的 目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在 扩增延伸阶段将探针切断，探针被水解，从而导致报告荧光基团和 淬灭荧光基团距离变远，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光 信号得以释放出来而被仪器检测到，从而实现对亚欧型FMDV的检 测。