[发明专利]利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法。

背景技术

在氧化还原酶中，大约80％的氧化还原酶需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺， NADH)作为辅酶，10％的氧化还原酶以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺，NADPH) 为辅酶，只有很少一部分以黄素(FMN，FAD)和辅酶Q(PQQ)为辅酶。使用氧化还原酶 进行生物催化时，合成产物的同时会消耗一定量的辅酶。辅酶的高效供应是开发氧 化还原酶催化反应的关键技术之一。辅酶价格昂贵，每摩尔氧化型辅酶I(NAD⁺)的 价格约为1300欧元，PQQ的价格则超过了2700000欧元每摩尔，而且辅酶稳定性低， 从技术经济角度考虑，投加大量的辅酶是不可行的。根据生物催化反应的过程经济 性和工业可行性，氧化还原酶在应用中除了必须有合适的酶和反应工程技术以外， 还必须提供高效、低成本的辅酶再生系统。

利用辅酶再生系统，不仅能够降低成本，而且可以通过与合适的辅酶再生反应 相耦合，使原本热力学上不易进行的反应变得容易发生。辅酶再生主要有化学法， 电化学法，光化学法，酶耦联法和整细胞生物转化再生辅酶。酶耦联法是利用两个 平行的氧化还原反应酶系统，一个酶催化底物转化，另一个酶则催化辅酶循环再生。 为了达到最佳效果，两个酶的底物应相对独立，以避免两个底物竞争同一酶的活性 中心。酶耦联法再生效率高，但由于需要外加酶和对应的底物，再生系统较复杂， 过程控制难。辅酶再生系统中的酶可以是游离状态的，也可以是整细胞。用游离酶 作为生物催化剂有如下的优点：只使用一两种酶，能够避免副反应，从而使还原反 应具有对映选择性，同时下游的工艺过程也可以被简化，和整细胞催化相比，可以 忽略扩散的限制。但是，使用游离酶时需要添加辅酶，且游离状态的酶对高浓度的 底物和有机溶剂敏感。整细胞催化具有如下的优点：酶处在它们的自然环境当中， 更稳定，在发酵过程当中细胞具有内部的辅酶再生系统，仅添加葡萄糖就足以推动 反应的进行。

酶法再生NAD⁺一般常用酶为谷氨酸盐脱氢酶、乳酸脱氢酶、酵母酒精脱氢酶或 者NADH氧化酶。其中，NADH氧化酶由于只需要氧气参与，且产物为水，没有其他副 产物的生成，因此是极具潜力的NAD⁺再生体系之一。在实际应用中，依赖NAD⁺的R型 特异乙醇脱氢酶(R-specific ADH)可以在R，S-1-苯基乙醇中让R型对映体完全氧化， 从而生产纯的S对映体，NADH氧化酶与此反应过程耦合，为ADH提供再生NAD。目前 采用该酶再生的转化数TTN(每摩尔辅酶用于转化生成目的产物的摩尔数)一般可以 达到100到60之间。但是采用纯酶进行再生成本高，酶活性不稳定，特别是对于NADH 氧化酶目前纯化成本还相当高，而且能用的酶的种类非常有限。相对而言，采用整 细胞催化再生辅酶的操作简便，反应稳定，成本低。但是由于NADH为带电分子，且 分子量较大(709.4Da)，通常很难进入细胞进行反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法。

本发明所提供的再生氧化型辅酶I的方法，是在缓冲溶液中，以还原型辅酶I (NADH)为底物利用产气肠杆菌将还原型辅酶I转化为氧化型辅酶I(NAD⁺)。

其中，所述缓冲溶液可以为各种缓冲溶液，如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES 缓冲液或三乙醇胺缓冲液等，只要能保证反应在适合的pH范围内进行的缓冲溶液 均可。所述缓冲溶液的pH具体为4.0-9.0。所述缓冲溶液中所述还原型辅酶I的浓 度为0.02mM-10mM。所述方法中，反应温度为4-50℃，在该温度范围内，产气肠杆 菌NADH氧化酶都具有活性，所述温度优选为37℃。所述产气肠杆菌可以是死菌体， 也可以是活菌体，只要产气肠杆菌中的NADH氧化酶存在并具有活性，就可将还原 型辅酶I转化为氧化型辅酶I。