[发明专利]一种含利钠肽基因的药物及制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组质粒，其特征是：它是由如下方法制备的：

（1）以如下引物对为引物，以Norway大鼠肾脏组织总RNA为模板，扩增利钠肽基因片段；

上游引物：5’-AGGATCCATCGG CACCAT GCA-3’

下游引物：5’-GGAATTCGCTGCACTAACATC-3’

其中，Norway大鼠肾脏组织总RNA的提取如下：

将该步骤所使用的器材预先用0.1% 的DEPC水处理，再按照Invitrogen公司TRIZOL?Reagent操作说明进行：

1）取新鲜正常Norway大鼠肾脏组织约100 mg，剪碎后迅速加入液氮研磨；

2）加入1 ml TRIZOL，继续研磨，直到组织完全破碎；

3） 将上述组织的TRIZOL裂解液转入EP管中，在室温下放置5 min；

4）在上述EP管中，加入0.2 ml氯仿，盖上EP管盖子，用力震荡15 sec，室温放置3 min后，4℃下12,000 g离心15 min；

5）取上层水相置于新EP管中，再加入0.5 ml异丙醇，室温放置10 min, 4℃下12,000 g离心10 min；

6）弃上清，加1 ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，4℃下7,500 g离心5 min，弃上清；

7）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

8）用100 μl不含RNA酶的水溶解RNA沉淀，分装后置-80℃冰箱保存备用；

（2）以限制性内切酶BamH I和EcoRⅠ双酶切pCDF1-MCS2 -EF1-copGFP空载体和步骤（1）扩增的利钠肽基因片段，用T4DNA连接酶连接，构建表达质粒；

（3）将脂质体Lipofectamine2000介导的pPACKF1? Packaging Plasmid Mix 和表达质粒共同转染293FT细胞，包装病毒，293FT细胞转染后48及72h，收获培养基上清，经离心过滤，去除细胞碎片，然后进行超速离心，将沉淀用PBS重悬，即收获了浓缩的含重组质粒的慢病毒。

2.一种药物组合物，其特征是：含有权利要求1所述的重组质粒。

3. 一种制备权利要求2所述药物组合物的方法，其特征是：

a、以如下引物对为引物，以Norway大鼠肾脏组织总RNA为模板，扩增利钠肽基因片段；

上游引物：5’-AGGATCCATCGG CACCAT GCA-3’

下游引物：5’-GGAATTCGCTGCACTAACATC-3’

其中，Norway大鼠肾脏组织总RNA的提取如下：

将该步骤所使用的器材预先用0.1% 的DEPC水处理，再按照Invitrogen公司TRIZOL?Reagent操作说明进行：

1）取新鲜正常Norway大鼠肾脏组织约100 mg，剪碎后迅速加入液氮研磨；

2）加入1 ml TRIZOL，继续研磨，直到组织完全破碎；

3） 将上述组织的TRIZOL裂解液转入EP管中，在室温下放置5 min；

4）在上述EP管中，加入0.2 ml氯仿，盖上EP管盖子，用力震荡15 sec，室温放置3 min后，4℃下12,000 g离心15 min；

5）取上层水相置于新EP管中，再加入0.5 ml异丙醇，室温放置10 min, 4℃下12,000 g离心10 min；

6）弃上清，加1 ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，4℃下7,500 g离心5 min，弃上清；

7）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

8）用100 μl不含RNA酶的水溶解RNA沉淀，分装后置-80℃冰箱保存备用；

b、以限制性内切酶BamH I和EcoRⅠ双酶切pCDF1-MCS2 -EF1-copGFP空载体和步骤（1）扩增的利钠肽基因片段，用T4DNA连接酶连接，构建表达质粒；

c、将脂质体Lipofectamine2000介导的pPACKF1? Packaging Plasmid Mix 和表达质粒共同转染293FT细胞，包装病毒，293FT细胞转染后48及72h，收获培养基上清，经离心过滤，去除细胞碎片，然后进行超速离心，将沉淀用PBS重悬，即收获了浓缩的含重组质粒的慢病毒；

d、将重组质粒制备成药物制剂。

4. 权利要求2所述的组合物在制备治疗青光眼药物中的应用。

5、根据权利要求4所述的应用，所述药物为注射剂。