[发明专利]蚕豆染色病毒检测用引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及蚕豆染色病毒检测用引物。

背景技术

蚕豆染色病毒(Broad bean stain virus，BBSV)是豇豆花叶病毒属(Comovirus)重要病毒之一，主要自然寄主为豆科植物。BBSV易于汁液传播和种子传播，种传率可达10％。由于BBSV可引起严重经济损失，我国一直将其列入《进境植物检疫性有害生物名录》，是重要的检疫性病毒。国内外学者对该病毒的研究较少，甚至没有公开的基因序列，因此一直没有针对BBSV的分子检测方法。2006年，国家科技支撑计划项目—《潜在入侵物种侦测技术研究》将BBSV检测方法作为子课题中研究内容之一，目的是填补多年来这一重要检疫性病毒缺少分子检测方法的空白，提高口岸防范BBSV的技术水平。本申请发明人在国际上首次测定了BBSV外壳蛋白基因序列，设计特异性引物，通过反转录(reverse transcription，RT)和聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，PCR)建立了BBSV的RT-PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。

发明内容

本发明目的在于提供用于蚕豆染色病毒RT-PCR检测的引物序列。

本发明通过分析已报道的BBSV外壳蛋白基因序列，设计BBSV特异性引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。

本发明还进一步给出了应用上述引物的RT-PCR检测方法，其以样品总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增的499bp DNA片段判定结果。

具体地说本发明以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应。RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。

首先在20μL反应体系进行反转录反应，即在0.2mL的反应管中加入6.75μLDEPC处理水，4μL总RNA，1μL BBSV-SCPr(10μmol/L)，1μL dNTP(10mmol/L)，混匀后于65℃保持5min，迅速转移到冰上骤冷5min；然后向反应管中加入2μL DTT(0.1mmol/L)，4μL5×反转录缓冲液，1μL RNA酶抑制剂(40U/μL)，0.25μL反转录酶(200U/μL)，42℃反应50min；72℃15min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。

PCR反应体系为50μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入30.5μLDEPC处理水，2μL cDNA，2μLBBSV-SCPf(10μmol/L)，2μLBBSV-SCPr(10μmol/L)，10×PCR缓冲液5μL，8μL dNTP(2.5mmol/L)，0.5μL DNA聚合酶(5U/μL)。反应条件为：94℃，5min；94℃30s，54℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸5min。

进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明根据蚕豆染色病毒外壳蛋白基因序列设计引物，该引物可用于BBSV的RT-PCR检测。本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否有BBSV，为进出口安全提供了保证。

附图说明

图1是BBSV RT-PCR方法的特异性试验结果。1-10为显症叶片的检测结果，11-13为健康叶片的检测结果。

图2是BBSV RT-PCR方法的灵敏度试验结果。1-6为发病样本，50μL反应体系中总RNA分别为5μL，4μL，3μL，2μL，1μL，0.5μL。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1引物设计和合成

根据BBSV外壳蛋白基因序列(登陆号FJ028650)，采用引物设计软件Primer5.0设计引物，引物序列为：

BBSV-SCPf(正向)：5’-Tgg CAA gTC ACA gTT CgC-3’

BBSV-SCPr(反向)：5’-CgC CTC TTT ggT TTC ACg-3’

实施例2总RNA的提取

1)取0.2g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；

2)室温下保持5min，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持2-15min后，4℃，12000g离心15min；

3)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温下保持15min；