[发明专利]6、11型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速定量检测6、11型人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)血清DNA的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，属于 生物技术领域。

背景技术

人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒， 在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良 性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣 以及生长在粘膜上的乳头状瘤。HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，HPV 基因组是一闭环双股DNA，分子量5×10⁶道尔顿。按功能可分为早期区(E区)、 晚期区(L区)和非编码区(ncr)三个区域。E区分为E1～E7开放阅读框架，主 要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。L区分L1和L2，分别编 码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。ncr是E区与L区间-6.4～1.0bp的DNA片段，可 负责转录和复制的调控。

临床上，根据HPV亚型的致病力大小或致癌危险性大小不同，可将HPV分 为低危型和高危型两类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性 大小阴唇、尿道口、阴道部位的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤，其病 毒亚型中最常见的有HPV6、11型。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要 的是可引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤，其病毒亚型中最常见 的有HPV16、18、31、33型。

HPV(6，11)引起生殖器尖锐湿疣，组织学特征为棘层出现成片的空泡化细胞， 棘层细胞及基底细胞增生，炎细胞浸润，但在慢性炎症及其它病毒感染，也出现空 泡或空泡样变。尖锐湿疣病程较长者，空泡化细胞数量稀少或单个分散。因此在 某些仅表现非典型病变的病例进行病毒检测显得尤为重要。

国外有不少学者报告，在尖锐湿疣中由HPV6、11型引起的尖锐湿疣感染占 90％以上，，少数为HPV16、18型感染或HPV30、31，33、35型感染或与HPV11、 16型等亚型混合感染。在我国，一些研究表明尖锐湿疣损害中HPV亚型所占百 分比各有不同。朱学骏等对250例尖锐湿疣的HPV感染进行分型，结果表明尖锐 湿疣感染亚型以HPV6型及HPV11型最为常见，感染率分别为84％和68％，但高 危型HPV16、18型感染并不少见，分别为14％和16％，结果还表明尖锐湿疣复合 感染常见，达66％，以HPV6、11型复合感染最常见。刘宝印等在206例宫颈尖 锐湿疣患者HPV阳性的84例中，HPV6、11型检出率为33.5％，HPV16型为1.5％， HPV18型为0％，其他HPV亚型为5.8％。

目前检测病毒有多种方法，免疫组化法检测的是病毒抗原，由于病毒DNA在 转录时部分丢失，蛋白水平降低，致使有些有典型组织学改变的病例也出现阴性。 原位杂法是利用探针与组织中的DNA杂交，首先将探针和组织中的双链DNA 变性为单链，然后使探针与组织杂交，而影响原位杂交的关键因素是杂交链的稳 定性，在杂交过程中，部分探针单链复性，使杂交率降低，影响HPV2DNA的检出 率。FQ PCR是近几年发展起来的新的核酸检测技术，该技术在常规PCR基础上添 加了一条标记了2个荧光基因的荧光双标记探针。一个标记在探针的5’端，称 为荧光报告基团；另一个标记在探针的3’端，称为荧光抑制基团。两者构成能 量传递结构，即5’端荧光基团所发出的荧光可被3’端荧光基团吸收或抑制。 实时荧光定量PCR技术在PCR过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变 化。当信号增长到某一阈值(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，计算出 以99.7％的置信度大于平均值的荧光值，即为阈值)时，循环次数(Ct值)就被 记录下来。该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。 利用阳性梯度标准品的Ct值，制成标准曲线，再根据样品的Ct值就可以准确定 出起始DNA的数量。

FQPCR技术把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物 分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增 产物进行实时动态检测和自动分析结果。该技术从根本上解决了PCR扩增产物 污染和不能定量的问题，并且通过探针杂交进一步提高了检测HPV DNA的特异 性。