[发明专利]黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明专利属于生物技术工程领域，特别是涉及一种植物病毒黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)的快速检测方法。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)是一种正单链RNA病毒，属烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，主要分布在罗马尼亚、波兰、丹麦、英国、芬兰、德国、前苏联、希腊克里特岛、中国台湾、日本、韩国、印度、伊朗、沙特阿拉伯、以色列、巴西等地。在自然界该病毒主要侵染葫芦科作物，引起叶片斑驳、灼泡状和畸形，并伴随植株生长矮化，是葫芦科作物上最具威胁的植物病毒病害。CGMMV侵染黄瓜引起叶片斑驳、水泡及变形，植株矮化、结果延时甚至导致不孕，果实大部分黄化或变白并产生黑绿色水疱状的坏死斑，产量损失达15％以上；在前苏联的Georgia地区，黄瓜发病率达80～100％。CGMMV早期侵染的西瓜(Citrullus vulgaris)植株生长缓慢，出现花叶，果实中严重变色或果实内部造成腐烂，果肉纤维化，果实产量下将30％。在中国，2002年首次从日本引进的种苗中截获CGMMV，2004年厦门动植物检疫局又从日本进口的南瓜种子上检测到CGMMV。2005年辽宁省盖州市感染CGMMV的西瓜面积达333hm²，绝收的13hm²。2006年12月21日农业部发布788号公告，将黄瓜绿斑驳花叶病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物，属国家三类检疫性病害。

CGMMV可经多种途径传播，以种子传播和接触性传染为主要传播途径。随着种子运输，病毒可长距离传播到新的地区或国家，给当地农业生产带来很大的威胁，如日本从印度进口带毒的葫芦种子，导致该病毒在日本定殖扩散，给日本的葫芦科作物的生产带来毁灭性的打击。因此，加强种子带毒检测，建立CGMMV的快速、准确、可靠的检测方法，对于防止该病毒进一步扩散，保护农业生产，具有十分重要的意义。

目前传统的生物学、血清学、电子显微镜技术和反转录PCR等检测方法都各有优缺点。反转录PCR作为一种比血清学更加灵敏的技术，可以对CGMMV进行准确的检测。实时荧光定量PCR技术是近年新发展起来的一项检测技术，是反转录PCR技术的延伸，它通过监测每个扩增循环中所收集的荧光信号，可以实时的、定量的检测目的基因，该方法在病毒的定量评估研究中显示了巨大的潜力，在植物病毒检测领域已得到了广泛的应用。因此，本发明利用实时荧光定量PCR技术，建立一套快速、简便、准确、灵敏的CGMMV定量检测方法，并应用此方法对西瓜种子携带的CGMMV进行了检测。

发明内容

基于上述研究领域中的空白，本发明提供了西瓜种子携带的黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测技术，为植物病毒检测提供了一种新方法。

黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法，采用一步实时定量RT-PCR反应，其特征在于靶基因为CGMMV分离物CP基因。

所述RT-PCR反应体系中的引物对和探针为：

引物对：CGMMV-F：CCAGACTCAAGCGGGAAGAG，

        CGMMV-R：TCTACGACAGACGAGGGTAACG，

探针：CGMMV-T：5`FAM TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT BHQ-13`。

      所述RT-PCR反应体系为：

2倍反应缓冲液            10μl

Ex Taq聚合酶(5U/μl)      0.4μl

预制反转录反应液         0.4μl

上游引物(10μM)           0.2μl

下游引物(10μM)           0.2μl

探针(10μM)               0.2μl

总RNA                    2μl

水                       6.6μl

总体积                   20μl

所述RT-PCR反应条件为：42℃反转录5min；95℃变性5s；95℃ 10s，60℃ 1min，45个循环。

所述黄瓜绿斑驳花叶病毒为西瓜种子携带的黄瓜绿斑驳花叶病毒。