[发明专利]头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种兽药残留的免疫化学速测技术，特别是涉及一种用于头孢氨苄残留检测 的酶联免疫检测试剂盒及其应用。

背景技术

头孢氨苄(Cephalexin)是β-内酰胺类抗生素。兽医临床广泛用于控制奶牛的乳房炎，治疗 动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均 可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害。针对该药物在食品中的残留，我国 农业部发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，牛奶中的最大残留限量为100μg/kg， 肌肉、脂肪中的最大残留限量为200μg/kg。

目前，用于检测头孢氨苄的方法主要有微生物法、色谱法或色谱-质谱联用分析法、免疫 分析法等。微生物检测法操作简单，但其检测周期长且结果误差较大。色谱法或色谱-质谱联 用技术虽然灵敏度高，但是样品前处理及测定操作繁琐、费用高，不适于大量样品的快速检 测。

免疫分析法(Immunoassay)具有极高的选择性和灵敏度，是广泛使用的快速筛查方法。 基于酶标记物放大作用的免疫分析称为酶联免疫吸附试验法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，即ELISA)，ELISA以其具有灵敏、快速、特异、简便等优点，广泛应用于现场监控 和大规模样品筛查。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样 本筛查，用于检测牛奶及动物组织中头孢氨苄药物残留量的酶联免疫检测试剂盒。

一种头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒，其中设置有以下成分：

包被有包被原的酶标板，所述包被原为头孢氨苄与载体蛋白的偶联物；

头孢氨苄特异性抗体；

酶标记物；

头孢氨苄标准品溶液：0μg/L-5μg/L；

底物显色液；

终止液；

浓缩洗涤液；和

样品稀释液。

本发明的试剂盒，其中所述酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.5-1μg/mL， 每孔加入100μL，37℃温育2h，再4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次30秒， 拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜 真空密封保存。

本发明的试剂盒，其中所述酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH9.6，0.05mol/L的 碳酸盐缓冲液；所用的封闭液是1％-5％牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。

本发明的试剂盒，其中所述头孢氨苄特异性抗体为头孢氨苄单克隆抗体，其是用头孢氨苄与 载体蛋白采用碳化二亚胺法得到的偶联物作为免疫原，利用杂交瘤技术得到的。其具体制备 过程为：

(1)动物免疫：采用雌性BALB/C纯系小鼠作为免疫动物，以头孢氨苄与载体蛋白牛血清白 蛋白偶联物为免疫原；

(2)细胞融合与克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株， 得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(3)单克隆抗体的制备与纯化：使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，5 天后腹腔注射杂交瘤细胞株10⁶个/只，7天后取小鼠腹水，进行纯化后得单克隆抗体分装， -20℃保存。

本发明的试剂盒，其中所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、甲 状腺蛋白(BCG)、卵清蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)等常用蛋白。

本发明的试剂盒，其中所述酶标记物为酶标记羊抗鼠抗抗体，其中酶标记物的标记酶为辣根 过氧化物，酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用过碘酸钠法将标记酶与羊抗鼠抗抗体进行偶联得到 的。

本发明的试剂盒，其中所述底物显色液由体积比为1：1的显色液A液和显色液B液组成， 显色液A液为过氧化脲，显色液B液为四甲基联苯胺。

本发明的试剂盒，其中所述终止液为1-2mol/L的硫酸。所述浓缩洗涤液为pH7.4含0.5％-1％ 吐温20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。所述样品稀释液为含有0.1％-1％牛血清白蛋白的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液。

本发明还提供一种利用所述的头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒检测头孢氨苄残留的方法， 包括以下步骤：