[发明专利]一种体外检测结核杆菌感染的试剂和方法

说明书

【技术领域】

本发明属于生物医学检验领域，涉及细胞免疫学检验方法，具体地说， 涉及一种检测结核分枝杆菌感染的试剂和方法。

【背景技术】

由人结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)所引起的结核病是 严重危害人类健康的传染病。近二、三十年来由于人口流动，耐药结核菌传 播，艾滋病等因素影响，结核病疫情在全球范围内回升。如今已成为所有传 染病中的最大死亡原因(已经超过了狂犬病)，成为青年人的第一杀手。全 球1/3的人口(约20亿)已感染了结核菌，95％发生在发展中国家。其中， 2000万是活动性结核病患者，每年新增加800～1000万肺结核患者，其中， 75％的人年龄在15～50岁。全球每天有8000人、每年有200～300万人死于 结核病，其中，发展中国家占98％。我国疫情也相当严重，是全球22个结核 病高负担的国家之一。结核病人数位居世界第二，仅次于印度。全国超过1/3 的人口(5亿)感染了结核菌，其中10％的人发生结核病。如果得不到有效控 制，在未来10年里，可能有3000万人发生结核病。

由于存在早期诊断困难，在全国实施直接督导治疗(DOTS)策略后，中 国的结核发病率并没有预期地出现明显下降，这与潜在的大量未被诊断出的 潜伏感染以及痰菌阴性结核病人未被及时诊断有关，这些感染者成为一个巨 大的结核病源，DOTS计划能针对发病的肺结核患者，而对于控制潜伏感染的 病人或者痰菌阴性的症状不典型的患者没有贡献。

现有的临床实验诊断方法包括以结核菌素(PPD)试验检测Mtb感染者的 迟发性超敏反应、痰涂片抗酸染色寻找Mtb、Mtb的分离培养、血清抗体检测 及核酸成分检测等。这些方法在结核的实验诊断和研究中发挥了重要作用。 但也还存在一些不足，如难以早期诊断及很好地预测预后、培养法耗时长， 需要4～8周时间；痰涂片抗酸染色等不能诊断肺外结核且敏感性差；难以准 确了解机体实际感染及免疫状态；而艾滋病合并结核时PPD试验常常为阴性， 出现典型结核临床表现时病人一般已进入终末期；由于PPD试验和抗体检测 采用的大多为多成分抗原，并不能将Mtb感染者与卡介苗(BCG)接种者和 非结核分枝杆菌(如艾滋病人群常感染的鸟-胞内分枝杆菌等)感染者区分开。 因此，为解决现有的临床实验诊断方法的局限性，研究灵敏度高、特异性好 的细胞免疫学临床实验诊断方法非常必要。

特异性抗原诊断一直是确认和评估病原体感染及感染状况较为可靠的方 法，且有早期诊断价值，已经在HBV、HCV、HIV等疾病的诊断方面获得了 广泛的应用。由于人体在对抗结核杆菌的感染中，细胞免疫起到了关键性的 作用，所以寻找结核杆菌特异性的T细胞抗原和检测T细胞免疫反应已经成 为近年来研究的热点。国际上已有报道的T-SPOT试剂正是使用结核杆菌的特 异性蛋白抗原ESAT-6和CFP-10中的一些多肽，以ELISPOT方法(如 T-SPOT.TB试剂)诊断结核早期感染(专利号CN 1350546A)。但有研究显 示T-SPOT.TB试剂在一些国家的效果并不理想，推测可能与这些国家人群的 主要组织相容性抗原有不同而所使用的多肽主要是针对欧洲国家人群筛选而 出、以及这些国家人群非结核分枝杆菌感染率高等有关。另外T-SPOT.TB试 剂价格昂贵，每一人份约合80美元，在发展中国家难以推广。

【发明内容】

本发明的目的就是为了提供一种检测结核分枝杆菌感染的试剂，它具有灵 敏度高、不受BCG疫苗及非结核分枝疫苗杆菌干扰、特异性好、既能检测活 动性的肺结核患者、又能检测潜伏感染的病人、还可以检测健康的结核分枝 杆菌接触者的优点。

本发明的目的还在于提供一种检测结核分枝杆菌感染的方法。

本发明的目的还在于进一步提供基于上述多肽的诊断试剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：

以Overlap(重叠)方法设计Mtb特有而其他分枝杆菌(包括卡介苗和非结 核分枝杆菌等)不具有的早期分泌抗原靶位-6(ESAT-6)21条多肽，每一多肽 含14或15个氨基酸，以ELISPOT对PPD阳性结核病人淋巴细胞进行检测， 筛选出1条与T-SPOT.TB试剂所使用不同的特异性T细胞反应性Mtb多肽： 多肽M233氨基酸序列为SEQ ID No.1，本发明也可以是其类似物，所述的类 似物是指具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选90％以上同源行序列。