[发明专利]肠道病毒71型核酸检测用引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，特别涉及肠道病毒71型核酸检测用引物、探针及 试剂盒。

背景技术

肠道病毒71型(Enterovirus type71，简称EV71)为单股正链RNA病毒，属于 小RNA病毒科(Picoranviridae)。EV71是嗜神经性病毒，除了引起儿童手足口病外， 容易导致严重的神经系统相关并发症，如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水 肿等，EV71致死率高。EV71感染一年四季均可发生，亚热带地区在夏秋季易于 造成流行。托幼机构是EV71流行、爆发的主要场所。造成EV71感染与流行除了 宿主因素外，还与病毒的种类、侵入易感者的病毒量、病毒毒性强弱以及人群的抗 体水平有关。另外，低劣的卫生条件和过度拥挤的居住环境在病毒的传播中起重要 作用。EV71主要通过粪-口途径在人群中传播，带毒的粪便可通过污染的手、餐具、 食物经口进入人体，咳嗽、打喷嚏形成的飞沫可直接或间接进行传播，另外，接触 病人破溃的疱疹液等也受到感染。幼儿普遍易感，易感性随年龄增长而降低。10 岁以下儿童比较容易受到感染，幼儿发病最多，3岁以下比较容易出现并发症，成 人患此病者较少，免疫功能不全的成人感染后，也有可能出现并发症。

自1974年从美国加利福尼亚爆发的表现为神经系统症状的患者首次分离到 EV71，许多国家和地区相继报道了EV71在不同地区的流行情况，1975年保加利 亚和1978年匈牙利发生严重EV71爆发流行，分别导致44例和45例死亡。近年 来，EV71在亚洲太平洋地区特别是东南亚地区的流行呈上升趋势，在过去的七年 间就发生过多次爆发流行，其中最为严重的有四次，分别是1997年，马来西亚， 30例死亡；1998年，台湾，78例死亡；2000年，台湾，25例死亡及2001年，台 湾，26例死亡。EV71已经取代脊髓灰质炎病毒成为肠道病毒中最受瞩目的成员。 2008年安徽、广东、浙江等28个省市受EV71病毒感染严重，超过三万儿童感染 该病，将近50人因该病而死亡，手足口病在2008年5月2日已被中华人民共和国 卫生部定为丙类传染病。

本发明选择肠道病毒71型VP1基因设计的用于荧光RT-PCR检测的引物及探 针序列，建立了肠道病毒71型荧光RT-PCR检测技术，反应结束即可根据扩增曲 线判定是否有肠道病毒71型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于肠道病毒71型实时荧光RT-PCR检 测的引物、探针序列及试剂盒，使得能够快速简单地判断样品是否有肠道病毒71 型，为手足口病的病原学诊断提供科学依据。

为了解决上述技术问题，本发明在分析已报道肠道病毒71型VP1基因序列的 基础上，分别设计引物及荧光探针。所述的引物由正向引物和反向引物组成，其核 苷酸序列如下：

正向引物：5’-AGTGATGAGAGTATGATTGAGACACG-3’；

反向引物：5’-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3’。

本发明设计的探针的核苷酸序列如下：

5’-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3’，

该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。其中，报告荧 光染料可采用下列荧光基团中的任意一种：Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、 Cy3和Cy5。淬灭荧光染料可采用下列荧光基团中的任意一种：Tamra、Rox、 Dabcyl、BHQ1和BHQ2。

根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团 的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针 的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料 吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过 程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活 性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信 号增强，从而实现对肠道病毒71型的检测。

本发明还进一步给出了应用上述引物和探针检测肠道病毒71型核酸的方法， 该方法是：以样品RNA为摸板，利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实 时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。