[发明专利]食源性致病菌核酸高效提取方法

权利要求书

1.一种食源性致病菌核酸高效提取方法，其组成包括：将细菌培养液离心，其特征是：向离心沉淀中加入缓冲液A,震荡并加入溶菌酶，温育后加入蛋白酶K,加入缓冲液B,剧烈振荡后，在温度65 ℃温育10 分钟,制成裂解溶液，通过硅基质SiO2材料的吸附膜收集高质量的核酸提取核酸溶液，能同时提取8种菌，包括G+菌和G-菌，并满足PCR- DHPLC检测条件的要求；所述的缓冲液A：20 mol/ L三羟甲基氨基甲烷TrisHCI、2 mol/ L乙二胺四乙酸EDTA、1.2%聚乙二醇辛基苯基醚Triton；所述的缓冲液B：0. 05 moL/ L三羟甲基氨基甲烷TrisHCI、 pH为7.6的0.1mol/ L氯化钠NaCI、0. 05 mol/ L乙二胺四乙酸EDTA、2 %十二烷基硫酸钠SDS。

2.根据权利要求1所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是：所述的细菌培养液离心为将1—5 mL细菌培养液以8,000 rpm的转速离心5分钟，吸净上清。

3.根据权利要求1或2所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是：所述的向离心沉淀中加入缓冲液A,震荡并加入溶菌酶，温育后加入蛋白酶K,加入缓冲液B,剧烈振荡后，在温度65 ℃温育10 分钟,制成裂解溶液的过程为：向细菌沉淀中加入250μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮，加入终浓度为20 mg/ mL的溶菌酶，在温度为37 ℃温育30分钟，向管中加入20 μL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K 溶液，混匀，再加入200μL缓冲液B，剧烈振荡后，在温度65 ℃温育10 分钟。

4.根据权利要求1或2所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是：所述的通过硅基质SiO2材料的吸附膜收集高质量的核酸提取核酸溶液过程包括：在裂解液中加入220μL无水乙醇，充分振荡后，转入一个具有吸附膜的吸附管内，吸附管放入收集管中，以12 000 rpm 转速离心1分钟 ,弃滤液，再向吸附管中加入500μL缓冲液C：0.3M醋酸钠NaAc、300μL无水乙醇, 以12 000 rpm的转速离心1分钟，弃滤液，再向吸附管中加入500μL漂洗液D：70%的乙醇溶液, 以12 000 rpm的转速离心1分钟，弃滤液，如此重复1次，最后以12 000 rpm转速离心2分钟，弃滤液；

将吸附管转入一个干净的收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL的TE缓冲液：10mM三羟甲基氨基甲烷Tris、1mM 乙二胺四乙酸EDTA室温放置2分钟，以12000rpm转速离心2分钟，滤液即为核酸溶液，再温度-20 ℃时保存备用。

5.根据权利要求3所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是：所述的通过硅基质SiO2材料的吸附膜收集高质量的核酸提取核酸溶液过程包括：在裂解液中加入220μL无水乙醇，充分振荡后，转入一个具有吸附膜的吸附管内，吸附管放入收集管中，以12 000 rpm 转速离心1分钟 ,弃滤液，再向吸附管中加入500μL缓冲液C：0.3M醋酸钠NaAc、300μL无水乙醇, 以12 000 rpm的转速离心1分钟，弃滤液，再向吸附管中加入500μL漂洗液D：70%的乙醇溶液, 以12 000 rpm的转速离心1分钟，弃滤液，如此重复1次，最后以12 000 rpm转速离心2分钟，弃滤液；

将吸附管转入一个干净的收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL的TE缓冲液：10mM三羟甲基氨基甲烷Tris、1mM 乙二胺四乙酸EDTA室温放置2分钟，以12000rpm转速离心2分钟，滤液即为核酸溶液温度-20 ℃时保存备用。

6.根据权利要求3所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是：所述的65 ℃温育10 min后，溶液将由乳浊液变成透明液，如果未变成透明，说明细菌没有彻底裂解。

7.根据权利要求4所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，用水做洗脱液时pH值在7.0-8.5范围内，核酸产物应保存在温度-20℃。

8.根据权利要求5所述的食源性致病菌核酸高效提取方法，其特征是：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，用水做洗脱液时pH值在7.0-8.5范围内，核酸产物应保存在温度-20℃。