[发明专利]一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种制备藻胆蛋白荧光探针的方法，特别是涉及一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法。

背景技术：

藻胆蛋白是很好的纯天然色素，有鲜艳的颜色，可用作食物色素、化妆品、添加剂等，同时，藻胆蛋白也是一种新型荧光物质，包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白等，可以作为抗体荧光标记物质以替代合成荧光物质，它们作为生物体内的荧光示踪物质，正被广泛应用于临床诊断、免疫标记等领域。特别是R-藻红蛋白(R-PE)因其极高的消光系数和量子产率，较大的斯托克(STOKES)位移，以及其黄橙色特征荧光，可以避开大多数生物环境中的内源荧光分子干扰，制成的荧光探针的检测效果显著高于传统的荧光标记物。但由于荧光探针制备工艺难度较大，所用的藻红蛋白及单克隆抗体的纯度要求又较高，使目前国内科研和医疗单位使用的藻红蛋白荧光标记物完全依赖进口，成为限制其扩大应用的瓶颈。

发明内容：

本发明的目的是要提供一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法，它不但能高效地制备R-藻红蛋白荧光探针，而且，工艺简单，成本低廉。

本发明的目的是这样实现的：本发明的一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法在温度为20℃条件下进行以下各步骤：

(1)以3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与R-藻红蛋白(R-PE)摩尔比为40∶1进行R-藻红蛋白(R-PE)的衍生化，摇床避光低速振荡2小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集衍生化的R-藻红蛋白(R-PE)；

(2)以二硫苏糖醇(DTT)与抗体摩尔比为500∶1进行抗体的巯基化，摇床低速振荡1小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集巯基化的抗体；

(3)按衍生前R-藻红蛋白与抗体的质量比3∶5的比例取衍生化的R-藻红蛋白与巯基化的抗体混合，摇床低速震荡12小时，后加入100μl的N-乙基马来酰亚胺，反应30分钟，接着以Sephacryl S-300HR层析柱分离纯化，洗脱液为50mmol/L磷酸盐缓冲液+150mmol/L氯化纳、PH7.0，收集分离的交联产物，即为条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针。

所述的摇床低速震荡为50转/分。

所述的N-乙基马来酰亚胺为用无水二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为80mmol/L。

所述的Sephacryl S-300HR层析柱为￠16mmX1000mm的SephacrylS-300HR层析柱。

由于本发明以条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)为材料，通过R-藻红蛋白(R-PE)衍生化、抗体巯基化，交联产物分离纯化等方法制备条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针，因此，具有以下优点：

1、藻胆蛋白来源丰富，我国是紫菜生产大国，年产量20亿张左右，目前市场上大多是自然凉干的紫菜，销售价格在每千克20-30元，而每吨饲料级螺旋藻干粉6-8万元人民币(60-80元/千克)，曾一度高达每kg30美元(约240元/千克)，是紫菜的十倍，因此本发明所用原料来源广泛，无需加工，成本相对于螺旋藻便宜的多；

2、目前从条斑紫菜提取高纯度藻红蛋白工艺简单，成本低廉，得率较高；

3、R-藻红蛋白(R-PE)检测效果好，R-藻红蛋白(R-PE)因其极高的消光系数和量子产率，较大的斯托克(STOKES)位移，以及其黄橙色特征荧光，可以避开大多数生物环境中的内源荧光分子干扰，制成的R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针的检测效果显著高于传统的荧光标记物。

附图说明：

图1是在明场下肝癌SMCC-7721细胞的形态。

图2是在绿色激发光下羊抗兔抗体检测SMCC-7721细胞(对照组)。

图3是在绿色激发光下R-藻红蛋白荧光探针检测SMCC-7721细胞。

图4是在绿色激发光下R-藻红蛋白衍生物R-PE-PDP检测SMCC-7721细胞(对照组)。

图5是在蓝色激发光下R-藻红蛋白荧光探针检测SMCC-7721细胞。

图6是在蓝色激发光下R-藻红蛋白衍生物R-PE-PDP检测SMCC-7721细胞(对照组)。

具体实施方式：

实施例1

本实施例中所用的材料为条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)和羊抗兔抗体，所述的条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)从上海安谱科学仪器有限公司购得，所述的羊抗兔抗体从武汉华美生物工程有限公司购得。