[发明专利]一种核酸等温扩增检测结核分枝杆菌活菌的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及结核分枝杆菌活菌核酸扩增检测技术。

背景技术

自1882年Koch发现结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是结核病的病原菌以来的100余年，人类对结核分枝杆菌的生物学特性、致病机制、耐药机制、诊断方法、抗结核药物的研制等方面都取得了巨大的成就。而如今，结核病仍然是影响人类健康流行性最广、病死率最高的感染性疾病之一。寻求快速、准确的诊断方法一直是结核病学首要研究的领域。

近10年来，随着分子生物学的发展，对结核分枝杆菌DNA的检测研究颇多，和培养方法比较，DNA检测的高敏感、高特异和快速性给结核病的诊断带来新的期望。但DNA作为半衰期较长的稳定核酸分子，据研究报道，在接受标准有效治疗的肺结核患者痰标本中，培养转阴后180天仍有25％的标本DNA检测阳性。可能的原因解释是标本中有死菌和DNA降解的延滞、L型培养以及持留菌和休眠菌的存在等。可见，以DNA为基础的检测，存在平台效应，不能用于结核分枝杆菌的活菌诊断。

核糖体RNA(rRNA)是生物细胞核糖体内的遗传物质，在原核生物中有多个拷贝存在，每个结核分枝杆菌的rRNA有近5000个拷贝。有学者在观察分枝杆菌体内外死亡降解的过程时发现，核糖体是第一个伴随细菌活力消失而降解的超微结构，因而认为rRNA可作为结核分枝杆菌的活菌标志。Van derVliet等通过体外扩增16S rRNA进行分枝杆菌活菌检测和药敏试验时发现，该方法能在3～7天内获得药敏试验结果，可计算出各种药物的药效学参数。但Hellyer等(J Clin Microbiol，37(2)：290-295，1999)的研究结果显示结核分枝杆菌的rRNA水平在含药培养基中72h内无明显变化。Moore等(J ClinMicrobiol，34(7)：1745-1749，1996)通过临床观察发现，rRNA也显示平台效应。所以，rRNA在用于结核分枝杆菌药敏试验和化疗监测时仍存在很大的局限性，也不能用于结核分枝杆菌的活菌诊断。

原核生物的mRNA分子，半衰期很短(仅有3～5min)，仅存在于活的、有代谢活性的菌体中，一般认为mRNA是一活性增殖细胞的很好的分子标记物。所以，以mRNA为靶标的检测只能是活菌，是监测药物敏感性和化疗反应的很好的分子指标。结核分枝杆菌的85-B mRNA编码的蛋白85-B，是结核分枝杆菌的主要分泌性蛋白抗原复合物85的组成之一，该抗原复合物作为结核分枝杆菌的特异性分泌蛋白，在液体培养基和巨噬细胞系统中表达非常丰富，所以活菌细胞内存在丰富的85-B mRNA分子。Desjardin等(Am J RespirCrit Care Med，160：203-210，1999)研究了经药物治疗肺结核患者痰液样本中提取的结核分枝杆菌85-B mRNA、16S rRNA以及IS110DNA含量和涂片染色、培养结果的关系，显示涂片培养测得的活菌数量与85-B mRNA含量相关性最好。因此，选择85-B mRNA为靶标可准确检测结核分枝杆菌的活菌。

在核酸检测过程中，多数情况下样本中的核酸含量较低，为了使检测达到一定的灵敏度和准确度，需要对样本中的待测核酸片段进行有效扩增，目前聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)和进一步发展的实时荧光PCR技术已经成为核酸扩增检测的主流技术手段，用于核酸模板的扩增及定性定量检测。虽然实时荧光PCR技术检测具有灵敏、快速的优点，但检测时需昂贵的循环变温设备、操作严格分区等因素而限制了其在基层医院的推广使用。目前，采用实时荧光PCR技术检测结核分枝杆菌，扩增的是样本中的总DNA，不能剔除样本中的死菌，因此不能用于结核分枝杆菌的活菌检测。