[发明专利]蚕电压门控钠通道基因、编码蛋白及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及鳞翅目昆虫家蚕(大造)的电压门控钠通道基因、编码蛋白及其克隆方法。

背景技术

电压门控钠通道(VGSC)在神经元以及其它可兴奋性细胞动作电位形成和传导过程中扮演着极为重要的角色。当细胞膜去极化时，VGSC被电压依赖性的激活，使胞外钠离子选择性通透进入胞内，形成动作电位的去极化相；VGSC在开放后几个毫秒时段里就会失活，失活的VGSC需要回到静息状态后才能再开放(Catteral，1992)。VGSC的细微突变或变化，将影响生理功能的异常(Lai et al.，2003)。哺乳动物钠通道基因亚型较多，如Nav1.1-Nav1.9和NavX，而昆虫钠通道基因的亚型相对较少，只发现2种亚型，即para基因和DSC基因。其中，仅para基因编码的钠通道在体外得以表达和功能鉴定，而DSC基因功能尚未得到鉴定(Goldin，2002)。目前已克隆和测序的昆虫para直系同源钠通道基因(para-orthologous sodium channel gene)有果蝇(Drosophila melanogaster)的para基因、家蝇(Musca domestica)的Vsscl基因(也称Msc基因)、烟草蚜虫(Heliothis virescens)的hscp基因、德国小蠊(Blattellagermanica)的para^CSMA基因、东亚钳蝎(Buthus martrensii)的BmNavl基因以及虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)的OhNavl基因(Loughney et al.，1989；Ingles et al.，1996；Miyazaki et al.，1996；Park et al.，1999Zuo et al.，2002)。昆虫钠通道存在于包括感觉神经元在内的昆虫神经系统，一般不表达在肌肉组织。细胞水平上的研究表明，昆虫钠通道在神经元的胞体与轴突上均有表达(Wicher et al.，2001)。

钠通道呈现出的亚型多样性，为理解钠通道在生理/病理下的功能特性及其动态平衡调控带来了复杂性，同时，也正在引发通道药理与毒理基因组学研究的挑战性。在神经系统中，各亚型的钠通道通常共表达于同一个细胞上(例如DRG神经元)，为了阐明各亚型参与的生理活动，有必要将各通道介导的电流成分分离，但由于钠通道各亚型介导的宏观电流性质接近，单用不同刺激方式无法获得单一电流；而体外表达虽可以获得单一亚型的信息，但表达体系以及辅助亚基的存在与否都会对通道的性质产生重大影响，而且失去了通道在体内时的复杂环境，增加了对钠离子通道认识的难度以及应用。例如，目前临床上癫痫、神经病理性痛等的治疗药物通常以钠通道为靶器，但由于其选择性不高，可能产生严重的副作用；昆虫钠通道是DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的主要作用靶点，但长期使用和滥用会导致昆虫产生抗药性，昆虫的para钠通道基因突变与抗药性密切相关(Williamson et al.，1996；Soderlund & Knipple，2003)。因此，解析新型钠通道亚型的基因编码特征，不仅有利于各亚型生理功能的阐明与药理价值的评估，同时也为钠通道关联的临床疾病治疗药物以及高效生物杀虫剂的研制提供理论的可行性和新分子先导物的开发。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种家蚕电压门控钠通道基因。

本发明的目的之二在于提供该电压门控钠通道基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供该电压门控钠通道基因的克隆方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种家蚕电压门控钠通道基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：

(1)具有SEQ NO 1所示的DNA序列；

(2)与序列表中SEQ NO 1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

一种上述的家蚕电压门控钠通道基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白具有序列表中SEQ NO 2的氨基酸残基序列或者是将SEQ NO 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ NO 1的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ NO 1衍生的蛋白质。

一种上述的家蚕电压门控钠通道基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.从家蚕的脑中提取总RNA；

b.用Superscript II反转录酶和Oligo-(dT)引物合成cDNA；