[发明专利]一种核酸等温扩增检测猪瘟病毒的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪瘟病毒核酸扩增检测技术。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)又称猪霍乱(Hog Cholera，HC)，是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种急性、热性高度接触性传染病，主要特征为急性经过、高热稽留、死亡率高和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等。自从1833年美国俄亥俄洲首先发现猪瘟以来，世界各地有关猪瘟的报道逐渐增多。近些年来，虽然采取各种措施对猪瘟进行了一定的控制，但其流行和发病又出现了新的特点，对养猪业的危害仍然十分严重。目前，猪瘟疫病的早期特异性诊断、染病动物捕杀和疫苗接种是有效预防猪瘟的重要手段。

传统的诊断猪瘟实验室方法主要有病毒分离培养、抗原检测、抗体检测以及核酸杂交等，这些方法在病毒的诊断和进出口检验检疫中起了重要作用，但普遍存在明显不足，例如检测耗时、操作复杂、检测灵敏度和特异性不足等，不适合大批量检测，给猪瘟的检测带来巨大困难。因此，建立一种快速、简便、特异灵敏的猪瘟病毒实验室方法显得尤为重要。

近年来，已经可以利用实时荧光逆转录-聚合酶链式反应(Reversetranscription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)技术检测CSFV RNA，虽然检测灵敏度很高，但检测需要复杂昂贵的循环变温设备，并且对操作人员的技术要求较高，限制了该技术的大规模推广使用。核酸等温转录扩增和纳米金探针检测方法(Nucleic Acid Isothermal and Transcriptional Amplificationwith Gold Nano-particle Probes，NITAG)是一种利用纳米金探针快速检测恒温扩增产物的新型核酸检测技术(原理参见附图1)。具体说来，NITAG技术首先利用一种多酶复合体所具有的逆转录酶、RNase H和依赖DNA的RNA聚合酶活性，在体外等温扩增核酸模板获得大量RNA扩增子，然后纳米金标记的寡核苷酸探针和这些RNA中的靶序列杂交形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网络结构，由此引发纳米金粒子光学性质的变化，产生杂交信号以杂交液/板/试纸颜色变化显示，存在相互作用的杂交液/板/试纸显示为蓝色，没有作用的显示为红色。利用该技术，微量RNA模板可通过等温扩增的模板拷贝数和纳米金探针检测的显色信号双级放大而得到检测，该检测技术具有无需特殊昂贵设备、检测灵敏快速、结果直观可见等优点。目前采用NITAG技术检测CSFV RNA的应用尚无公开报道，通过检测可以快速有效地诊断猪瘟病毒，适合于检验检疫领域使用。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于NATAG技术的猪瘟病毒RNA检测方法和试剂盒，对来自CSFV的RNA进行等温扩增和纳米金探针检测。

技术方案

本发明提供一种基于NITAG技术扩增猪瘟病毒RNA的5’端非编码区(5’-UTR)寡聚核苷酸引物对和探针，其中引物对具有SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的序列(SEQ ID NO：25’端含有能被T7RNA聚合酶识别的启动子序列)；检测探针具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列(前者5’端和后者3’端分别经过己烷巯基化处理)，捕获探针具有SEQ ID NO：5的序列(5’端生物素Biotin标记)。

SEQ ID NO1：5’-gAggTTAgTTCATTCTCgTA-3’20bp

SEQ ID NO2：5’AATTCTAATACgACTCACTATAggg TgTACTCAggACTTAgACCA-3’45bp

SEQ ID NO3：5’HS-(CH₂)₆-[CCCTCCAgCgACggCC]16bp

SEQ ID NO4：5’[CTAgCCATgCCCACA]-(CH₂)₆-SH3’15bp

SEQ ID NO5：5’BIOTIN-gCATgATTggACAAATCA-3’18bp

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

在实施方案中，本发明提供一种基于NITAG技术的扩增检测CSFV RNA的方法和试剂盒，所述方法包括步骤：