[发明专利]一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，可在非常短的时间内完成临床标本中EV71病毒含量的测定，属于分子生物学领域。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属成员。1969年首次从美国加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿的粪便标本中分离到EV71病毒此后，EV71病毒的流行范围遍及全球。据报道，EV71在世界范围内已引起十多次大的爆发与流行。目前，人类是EV71病毒唯一已知的自然宿主，病毒主要通过人群间的密切接触传播，病毒经过被感染者的口鼻分泌物、粪便和飞沫等传播。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，2008年在中国大陆爆发的手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)便是因EV71病毒引起的。中国大陆EV71的分子流行病学资料还不完整，EV71的采样标本主要来源于手足口病患者。中国大陆已报道的10例病毒株均为C基因型。

目前诊断方法包括：

(一)病毒分离和培养

常使用RD细胞(来源于人横纹肌肉瘤细胞)来进行病毒培养，得到初步结果需要至少一周的时间。

从HFMD患儿的脑脊液、血液、疱疹液等临床标本中分离出病毒有诊断价值，但单从咽拭子或粪便中分离到病毒不能确诊。从有上述临床症状群患者的咽拭子或粪便中重复分离到同一型病毒，且从周围患同样疾病者中也检出相同的病毒，且病毒分离率远高于正常人群，则有诊断的参考价值。

(二)测定人双份血清标本的中和抗体滴度

对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1∶256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1∶128判定为可疑阳性。

(三)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

或通过电泳进行检测，或通过荧光进行检测，但因使用两步RT-PCR，操作较为复杂，而且需要的时间比较长(通常完成全部检测需要3个小时)，电泳的方法容易导致污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，用于快速、简便的检测标本中EV71病毒的含量。

1.为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：将EV71病毒C基因型序列和coxsackievirus A16(CA16)病毒等其他肠道病毒序列进行比对，选择EV71病毒的特异、保守区设计多套PCR检测引物和探针，通过筛选来确定最佳的方案，最终确定为如下序列。

引物1：5`-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3`    (Seq No.1)

引物2：5`-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3`  (Seq No.2)

探针1：5`-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-3`(Seq No.3)

或者与上述序列同源性大于75％的序列、或者上述所有序列的碱基互补序列。

其中标记探针的荧光发光基团可以为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。

2.考虑到阳性临床标本的获取受到国家法规的管制，设计合成人工RNA序列用于标准品或阳性对照品等的制备。序列如下：

AGAGAUAGCCCUCCCUCUUGAAGGCACACCUAACCCAAAUGGUUAUGCUAACUGGGAUAUAGAUAUAACGGGUUACGCGCAAAUGCGUAGAAAGGUGGAGCUAUUCACCGACAUGCGCUU(120bp)(Seq No.4)