[发明专利]一种结核分支杆菌活菌RNA提取方法及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种用于定量检测结核分支杆菌活菌的荧光定量RT-PCR试剂盒，通过对从临床痰液中提取的结核分支杆菌活菌RNA逆转录成cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量待测标本中的结核分支杆菌活菌。

背景技术

自1882年Koch发现结核分枝杆菌是结核病的病原菌以来的100余年，人类对结核分枝杆菌的生物学特性、致病机制、耐药机制、诊断方法、抗结核药物的研制等方面都取得了巨大的成就。而如今，结核病仍然是影响人类健康流行性最广，病死率最高的感染性疾病之一。寻求快速、准确的诊断方法一直是结核病学首要研究的领域。

近10年来，随着分子生物学的发展，对结核分支杆菌的DNA研究颇多，它们的高敏感、高特异和快速性给结核病的诊断带来新的期望。但DNA是稳定的核酸分子，但DNA是稳定的核酸分子，半衰期长，在接受标准有效化疗的肺结核患者的痰标本，培养转阴后180天仍有25％的标本DNA检测阳性。可能的解释有死菌及DNA裂解的延滞和L型培养以及持留菌、休眠菌的存在等。可见，以DNA为基础的检测，存在平台效应，不能用于结核分支杆菌的活菌诊断。

rRNA是核糖体内的遗传物质，在原核生物中有多个拷贝存在，结核分支杆菌的rRNA有近5000个拷贝。有学者在观察分支杆菌体内外死亡降解的过程时发现，核糖体是第一个伴随细菌活力消失而降解的超微结构，因而认为rRNA可作为结核分支杆菌的活菌标志。Van der Vliet等通过体外扩增16SrRNA进行分支杆菌活菌检测和药敏试验时发现，该方法能在3～7天内获得药敏试验结果，可计算出各药的药效学参数。但Hellyer等的研究结果显示结核分支杆菌的rRNA水平在含药培养基中72h内无明显变化。Moore等通过临床观察发现，rRNA也显示平台效应。所以，rRNA在用于结核分支杆菌药敏试验和化疗监测时仍存在很大的局限性，也不能用于结核分支杆菌的活菌诊断。

原核生物的mRNA分子，半衰期很短(仅有3～5min)，仅存在于活的、有代谢活性的菌体中，一般认为mRNA是一活性增殖细胞的很好的分子标记物。所以，以mRNA为靶点的检测只能是活菌，是监测药物敏感性和化疗反应的很好的分子指标。结核分支杆菌的85-B mRNA编码结核分支杆菌85-B蛋白，85-B蛋白是结核分支杆菌的主要分泌性蛋白抗原85-B复合物的成分之一，85-B复合物是结核分支杆菌的特异性分泌蛋白，是在液体培养基和巨噬细胞系统中表达最丰富的蛋白之一，所以活菌细胞内存在丰富的85-B mRNA分子。因此，确定以85-B mRNA为靶点可检测结核分支杆菌的活菌。

荧光定量PCR技术的出现，为我们提供了一个定量检测85-B mRNA的准确方法。1966年美国Applied Biosystems公司推出了实量荧光定量PCR技术，该技术融汇了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作，一举克服了常规PCR技术的诸多难题。与常规PCR相比，有以下优点：1、可以进行准确的定量检测，可用于适用基因诊断的各种疾病。以HBV-DNA为例，它不仅能检测出乙肝病毒在病人体内的复制、传染的情况，更重要的是能作为一个量化指标，能定量检测出病人体内的病数，可以动态地观察病情病程，观察治疗效果，作为临床治疗的一个指标，可判断药物疗效，指导临床医师选择有效药物，确定药剂、药量和疗程以及分析治疗效果，确定进一步治疗方案等方面，有着重要而现实的意义。2、特异性极强，克服了假阳性的主要来源。3、定量范围宽，样品无需梯度稀释。4、操作迅速，无需PCR后处理，自动化程度高。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，通常以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，而将每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数设为Ct值。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的参考品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵横标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。