[发明专利]以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的细胞扩增方法，特别的是一种以rhDSL重组蛋白扩增造血干细胞及祖细胞的方法。

背景技术

近年来，造血干细胞移植(Haematopoietic stem cell transplantation，HSCT)已成为治疗血液系统恶性肿瘤、实体瘤、自身免疫系统疾病及某些基因缺陷疾病的重要手段之一。造血干细胞主要来源于骨髓、脐带血及动员后的外周血。尽管与其他来源的干细胞相比，脐血干细胞具有来源丰富、抗原性弱、移植后并发症少等优点，但又存在数量不足的缺陷，造成了成人移植的限制。为得到治疗所需的细胞数量，研究人员试图通过不同手段对HS/PCs进行规模化扩增。但是目前常用的方法扩增HS/PCs(Haematopoietic Stem/ProgenitorCells)的效率十分有限，而且HS/PCs在体外扩增的过程中自我更新能力下降并显示出分化的特征，导致其归巢和长期造血重建能力的降低，所以从根本上解决HSCT面临的供体严重短缺已成为亟待解决的问题。

Notch信号传导通路广泛存在于脊椎和非脊椎动物中，是影响细胞决定的重要通路之一，在进化上具有高度的保守性。Notch信号传导通路由Notch受体、配体及其下游的信号传导共同组成。相邻细胞间通过Notch受体传递信号可以调节包括干细胞在内的多种细胞的分化、增殖和凋亡，影响器官形成和形态发生。

干细胞是一类具有自我更新(self-renewing)和多向分化潜能的细胞，能够产生高度分化的功能细胞。Notch信号对多潜能干细胞的定向分化和自身复制具有决定性的调控作用。以干细胞为中心的再生医学是用功能正常的细胞或组织替代功能减退或受损的细胞组织，将定向分化后的细胞用于治疗阿尔茨海默症、帕金森病、糖尿病、白血病等疾病，Notch信号传导通路通过调节干细胞的分化增殖将在这一领域中发挥重要作用。在少数情况下，例如神经干细胞向星形胶质细胞分化的过程中，Notch信号传导通路具有促进分化作用。对于其它多种干细胞而言，当Notch受体与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；而当Notch信号活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞，Notch信号传导通路目前被认为是解决干细胞扩增的最有前途的研究方向之一。目前，Notch信号传导通路在干细胞再生医学中的应用主要集中在通过活化Notch信号通路进行干细胞的体外扩增培养。在干细胞培养过程中，活化Notch信号传导途径可以调控其增殖分化从而服务于以干细胞生物治疗和组织工程，其策略主要是在含有可溶性配体的培养基中培养干/祖细胞、或者将配体结合于固相表面以模拟体内配体的跨膜结构来培养干/祖细胞。由于每一种类型的细胞需要与其相适应的含有适量细胞因子和生长因子的独特培养条件，所以通过激活Notch通路来维持干细胞的培养和进行组织工程的研究还存在一些困难，尽管如此，在造血干细胞的培养中，通过激活Notch通路来维持干细胞的自我更新已经取得了一定的进展。鲁茁壮等(中国实验血液学杂志，2003，11(3)：222～226)克隆表达了人Notch配体Delta-like1(hD111)的胞外区(hD11-1^ext)，并经集落培养检测证实其对原始的造血祖细胞具有扩增作用。Han等(Blood，2000，95(5)：1616～1625)构建了来自于人hD111的可溶性重组蛋白hD111^NDSL(由DSL结构域及N-端序列构成)，经小鼠细胞体外实验证实，在联合其它细胞因子的情况下，可以抑制造血干细胞的分化并促进其增殖。

目前已经发现的人的Notch配体有Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3、Delta4。Notch配体的胞外区含有数量不等的EGF样重复序列以及N端保守的DSL(Delta/Serrate/Lag2)结构域，该DSL结构域在结合与活化Notch受体的过程中起关键作用。来自于野生Notch配体的重组蛋白或者多肽被认为是有效的Notch激活剂。体外实验已经证明，从Jagged1、Delta1中衍生而来的重组蛋白及多肽具有Notch激活特性(Shimizu K，et al.J Biol Chem，1999，274(46)：32961～32969)。