[发明专利]抗氧化酶交联的多聚血红蛋白及其制备

权利要求书

1.一种抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白是与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶化学交联的多聚血红蛋白，多聚血红蛋白由2-5个血红蛋白分子组成，所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白中，过氧化氢酶∶超氧化物歧化酶∶血红蛋白的比例为(50000U-400000U)∶(2500U-20000U)∶1g，所述血红蛋白溶液中的血红蛋白来源于人的离体血液，所述制备方法包括下列步骤：

A.将过氧化氢酶和超氧化物歧化酶按比例加入血红蛋白溶液中；

B.加入戊二醛进行交联反应，交联反应时，采用HPLC监测分子交联程度；

C.加入赖氨酸终止交联反应；

D.将终止反应的溶液进行中空纤维超滤纯化后浓缩并进行无菌过滤处理。

2.如权利要求1所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述来源于人的离体血液为过期人血。

3.如权利要求1所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，戊二醛：血红蛋白的摩尔比为8∶1-16∶1。

4.如权利要求1所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述戊二醛为质量百分比1.5％的戊二醛水溶液。

5.如权利要求1所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述赖氨酸为2M的赖氨酸水溶液。

6.如权利要求1所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤D中，中空纤维超滤的滤出限300kd，以磷酸缓冲液平衡，循环8-10体积，直至未修饰血红蛋白的含量小于5％，将纯化的修饰血红蛋白溶液浓缩至终浓度7g/dl左右后进行无菌过滤处理。

7.如权利要求1所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤D后，还包括：加入冻干保存剂抗坏血酸和葡萄糖，冻干后-20℃保存。

8.如权利要求7所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述抗坏血酸的终浓度为0.1-0.5g/L，所述葡萄糖的终重量百分比浓度为1-5％。

9.如权利要求1所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述血红蛋白溶液可通过下述方法获得：

A.将人的离体血液离心，分离并洗涤红细胞；

B.将红细胞与去离子水混匀制备红细胞溶血液；

C.离心，取上清以Tris-HCl缓冲液平衡后进行离子交换层析，洗脱收集后进行超滤处理，得到纯化的无基质血红蛋白溶液。

10.如权利要求9所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，红细胞与去离子水的体积比为1∶(5-9)，步骤C中Tris-HCl缓冲液为50mM pH8.0-8.5的Tris-HCl缓冲液。

11.如权利要求10所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，红细胞与去离子水的体积比为1∶(7-9)，步骤C中Tris-HCl缓冲液为50mM、pH8.0-8.2的Tris-HCl缓冲液。

12.如权利要求11所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，红细胞与去离子水的体积比为1∶9，步骤C中Tris-HCl缓冲液为50mM pH8.2的Tris-HCl缓冲液。

13.一种抗氧化酶交联的多聚血红蛋白，由权利要求1-12任一权利要求所述制备方法制得。

14.如权利要求13所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白，其特征在于，所述过氧化氢酶∶超氧化物歧化酶∶血红蛋白的比例为(100000U-300000U)∶(5000U-15000U)∶1g。

15.如权利要求14所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白，其特征在于，所述过氧化氢酶∶超氧化物歧化酶∶血红蛋白的比例为300000U∶15000U∶1g。