[发明专利]一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因及其基因工程菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，涉及一种编码高温强碱下具有木聚糖酶活性的改良基因、含有该改良基因的载体、基因工程菌株，该基因的制备和表达方法和菌株的制备方法。

背景技术

木聚糖酶[EC.3.1.2.8]以内切方式水解木聚糖分子中β-1.4-糖苷键，其水解产物主要是木二糖和木寡糖，在纸浆造纸、动物饲料、食品工业和能源工业具有很大的应用前景。木聚糖酶在造纸工业中可作为纸浆漂白助剂，不仅可以提高纸张的白度和强度，更可以减少传统漂白剂氯化物和次氯化物的排放，大大减少环境污染；在动物饲料中加入木聚糖酶，可以降解木聚糖，提高非反刍类动物对饲料的利用率；木聚糖酶能分解制备酒类和饮料的原料中所含有的一些非淀粉类多糖物质，达到澄清饮料和酒类的目的；木聚糖酶用于加工面包食品时，可以分解部分麸质物质，改变面包的松软度，大大提高口感；同时，木聚糖酶分解木聚糖所产生的低聚木糖是很有效的双歧因子，在人体的大肠中可以促进双歧杆菌等益生菌的增殖，调整菌群平衡，改善肠道功能，抑制肠道腐败，降低血脂胆固醇，增强机体的免疫功能。

目前人们已经从真菌、放线菌、细菌等多种微生物中分离克隆了大量木聚糖酶的编码基因。这些天然来源的木聚糖酶的最适反应温度大多在50-60℃左右，最适反应pH值大多在4.0-6.0(刘亮伟etal.，河南农业科学，2006，Vol6，14-18)，其酶学特性往往不能满足工业生产和应用的需要。例如在纸浆和造纸工业中，要求木聚糖酶在较高的温度(60-65℃)和较高的pH值(10-11)下对木材进行处理(Pickersgill R.W.et al.，Proteins，1997，Vol29，77-86)，这就对木聚糖酶的物理化学的稳定性提出了更高的要求。

发明内容

本发明的第一个目的是获得一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因。

本发明的第二个目的是获得表达上述木聚糖酶改良基因的基因工程菌株。

本发明的第三个目的是提供上述木聚糖酶改良基因和菌株的制备方法。

本发明利用分子定向进化技术获得了一种木聚糖酶改良基因(Xyn-CDBFV-G201C)，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO1所示。

本发明获得了一种耐高温耐强碱的木聚糖酶改良基因。作为改良基础的木聚糖酶C(Xyn-CDBFV)(EMBL Acc No.AF123252)来源于牛瘤胃真菌(Neocallimastixpatriciarum)(Liu etal.，Can.J.Microbiol.1999，Vol45，970-974)，该木聚糖酶基因最适反应温度是62℃，最适反应pH值6.0(Chenetal.，Can.J.Microbiol.2001，Vol47，1088-1094)。本发明将原木聚糖酶(Xyn-CDBFV)的601位的核苷酸由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶，相应的，201位的氨基酸残基由甘氨酸突变为半胱氨酸。分子动力学模拟以及定点突变实验结果均显示出在改良木聚糖酶中，201位与50位半胱氨酸形成二硫键(见图1和2)，该二硫键导致改良木聚糖酶热稳定性较原始木聚糖酶高。

本发明提供了一种含有上述木聚糖酶改良基因的核苷酸编码序列的质粒。该质粒可以是原核或者真核质粒。将含有本发明的木聚糖酶改良基因编码序列通过常规方法克隆至载体的多克隆位点，即可形成重组载体质粒。

本发明的质粒可以是原核质粒，例如大肠杆菌表达质粒，例如PET21a，PET30a等。该质粒也可以是真核表达质粒，例如酵母表达质粒。例如，该质粒可以是毕赤氏酵母表达质粒。比如pPIC9k，pPIC9等。

本发明还提供了一种含有上述表达质粒的酵母基因工程菌株。该菌株可以采用毕赤氏酵母基因工程菌株。例如，Pichia pastrois GS115，SMD1168等，用电转化等常规方法将含有本发明的木聚糖酶改良基因编码序列导入酵母菌株，通过筛选可以获得含有目的基因的菌株。该菌株在摇瓶中发酵、分泌表达木聚糖酶，表达水平可以达到5000-10000U/ml。

本发明还提供了上述木聚糖酶改良基因的制备方法，即以Xyn-CDBFV基因为模板，将其核苷酸编码序列第601位由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。也可以以Xyn-CDBFV基因为模板，进行随机突变，通过筛选较高温度(65-80℃)条件下，耐受性最佳即残余活性最高的突变体而得。