[发明专利]一种用于检测肉毒毒素的免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物化学领域，尤其涉及一种免疫层析试纸，具体来说是一种用于检测肉毒毒素的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术：

肉毒毒素是肉毒杆菌产生的外毒素，是食物中毒的主要原因之一。实验室检测肉毒毒素及定型对确诊和治疗具有重要意义，预防中毒最重要的是加强监测。到目前为止经典的小鼠致死及中和试验仍是最常用的肉毒检测方法。但该方法比较繁琐和耗时，检测成本昂贵，不易推广。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于检测肉毒毒素的免疫层析试纸及其制备方法，所述的这种用于检测肉毒毒素的免疫层析试纸及其制备方法繁琐、耗时、检测成本高的技术问题。

本发明提供了一种用于检测肉毒毒素的免疫层析试纸，所述的这种试纸包括一层纤维素膜，所述的纤维素膜上喷涂有抗肉毒毒素抗体溶液，所述的纤维素膜设置在一层吸水垫上，所述的纤维素膜上设置有一层金标垫，所述的金标垫为玻璃纤维膜或者树脂，所述的金标垫中设置有抗肉毒毒素抗体免疫胶体金探针溶液，所述的金标垫上设置有一层样品垫。

本发明还提供了一种用于检测肉毒毒素的免疫层析试纸的制备方法，包括一个制备抗肉毒抗体的步骤，一个制备抗肉毒毒素抗体免疫胶体金探针溶液的步骤，在所述的制备制备抗肉毒毒素抗体免疫胶体金探针溶液的步骤中，将HAuCl₄溶液与柠檬酸三钠溶液按比例混合，加热煮沸，制备胶体金溶液；去单克隆抗体与胶体金溶液混合，通过调节pH值及离子浓度进行抗体的金标记，获得制备抗肉毒毒素抗体免疫胶体金探针溶液，然后将抗肉毒毒素抗体溶液喷到纤维素膜上，室温晾干，然后粘贴于吸水垫上；将玻璃纤维膜或树脂浸泡到抗肉毒毒素抗体免疫胶体金探针溶液中，得到金标垫，干燥后粘贴于前述纤维膜上；在金标垫上粘贴样品垫，得到肉毒毒素免疫层析检测试纸。

本发明和已有技术相对比，其效果是积极和明显的。本发明运用单克隆抗体，依据免疫反应原理检测肉毒毒素，灵敏度高，特异性强，替代常规使用的动物致死及中和试验检测方法；同时本发明采用胶体金免疫层析技术，检测周期短，应用范围广，标本处理简单，使用操作便捷，检测成本低廉。而且本发明的产品可室温保存，无需冷冻、冷藏，检测结果可直接观察，不需要特殊检测设备，便于携带，适合于现场快速侦检。

具体实施方式：

实施例1检测肉毒毒素的免疫层析试纸的制备

材料

氯金酸(HAuCl₄.4H₂O)，分析纯，上海试剂一厂；

柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)，分析纯，北京化工厂；

A型毒素，兰州生物制品研究所，11OU/支；

牛血清白蛋白(BSA)，分析纯，进口分装；

聚乙二醇(PEG)，分析纯，进口分装；

硝酸纤维膜，购于美国Millipore公司，HF B 504；

玻璃纤维膜，购于南京双威实业公司；

1)制备抗肉毒抗体

皮下多点注射家兔(2ml/只)；毒素0.25mg+福氏完全佐剂免疫，10天后追加兔疫，共追加2次，末次追加后10天抽血。

2)制备免疫胶体金探针

i.将HAuCl4配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸腾，搅动下准确加入1.5ml的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)水溶液，液体颜色稳定成葡萄酒红色。即得到胶体金溶液。

ii.确定最低偶联抗体浓度：调节胶体金溶液pH9.0，将抗肉毒素抗体稀释为不同浓度，分别取6ul、10ul、15ul、20ul、25ul加入到1ml胶体金溶液中，混匀后于室温下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混匀，静置，10-20min后观察液体颜色，胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，即为稳定1ml胶体金所需抗体的最低浓度。

iii.将120％上述最低偶联抗体量的抗肉毒抗体加入到50ml胶体金溶液中，混匀后即得免疫胶体金探针溶液。