[发明专利]穿膜肽Tat介导的生长因子在透皮转运中的应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种穿膜肽Tat介导的透皮转运系统，适用于经皮给药系统和化妆品领域。

背景技术：

进入了21世纪，医学界面临了一个新的问题：如何将药物正确的运送到需施治的部位， 使药效得以最大化的发挥。美容界也面临同样的问题，为什么一些号称高科技纳米技术、原 料一流且价格不菲的美容膏、美容霜涂抹之后，效果并没有期待中的那么明显？所以近年来 医学界关于经皮给药、透皮吸收、缓释等学术的研究空前活跃。近十多年的研究发现免疫缺 陷病毒(HIV-1)转录激活因子Tat介导蛋白具有很好的穿膜效果，我们将Tat与生长因子家 族的蛋白结合后进行透皮转运的研究，发现该系列融合蛋白在透皮转运中透皮的速率和渗透 量显著高于其他的透皮转运系统，而且Tat修饰后的脂质体较未修饰的脂质体也能显著提高 活性物的透皮速率和数量，适用于经皮给药系统和化妆品领域。

1988年开始报导免疫缺陷病毒(HIV-1)转录激活因子Tat蛋白具有跨膜功能。1994年， FawellS等发现Tat蛋白衍生多肽片段可以在数分钟时间内将异源分子导入细胞中。而在过去 的十年的时间里，已有多篇报道称，从几百道尔顿的分子到大分子结构如直径达200nm的脂 质体，均可由穿膜肽Tat-PTD蛋白介导穿过细胞膜。穿膜肽Tat-PTD蛋白转导具有以下的特 点：1.内化不依赖于与受体的结合；2.非能量依赖的细胞内摄作用；3.硫酸肝素(HS)参 与内化作用。

Tat肽段可携带不同分子大小、不同结构和理化性质的物质进入到细胞内，因而很难对 其穿膜机制作出统一的解释。而可能的穿膜机制有以下几种：

1.直接穿膜

Nagahara等提出，Tat融合蛋白是直接穿膜进入细胞。以一种变性的、高能量的状态存 在，当在分子伴侣的帮助下蛋白再折叠时，释放能量以驱动转导进入细胞，或者当分子与膜 结合后，分子的动力驱动转导。Becker-Hapak等认为当蛋白处于一个高能量状态时，蛋白转 导是最有效的。

2.形成反向微团后穿膜

D.Derossi，S等认为Tat肽段是通过在形成反向微团后直接穿过细胞膜。首先，Tat侧链 上碱性基团阳离子部分和膜的阴离子部分(主要是磷脂层的磷酸基)之间的离子作用导致细 胞膜的局部出现内陷，促进了细胞膜对肽段的吸收。然后，磷脂重组，形成反向的微团，Tat 蛋白就在这个微团所形成的亲水腔内，被释放入细胞质内。但反向微团机理难以用于解释大 分子物质，如蛋白或结构更庞大的物质。

3.通过细胞内吞作用穿膜

Sandgren等发现连接于Tat-PTD的DNA和氨基葡聚糖蓄积在大的、酸性的新生细胞质 囊泡中，接着被转运至核。Ignatovich等的研究进一步证实了Tat-质粒复合物的摄入是通过胞 吞机理。Ferrari等用显微镜观察活细胞，发现融合了GFP的Tat-PTD的内化是通过细胞膜穴 样凹陷介导的机制进行的。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种穿膜肽Tat介导生长因子家族活性蛋白在透皮转运中的新用 途，特别是应用于经皮给药系统和化妆品领域。

它是通过分子克隆常规方法构建出Tat与生长因子家族中一系列活性蛋白及融合蛋白重 组表达载体，经不同的层析柱纯化获得融合蛋白，或者将Tat通过化学和(或)物理的方法 链接到天然或合成的磷脂中并制备成包裹生长因子的脂质体，形成Tat介导的脂质体透皮转 运系统，再辅以适当的药用或化妆品辅料制备成成品用于经皮给药系统或化妆品体系。

本发明的Tat蛋白介导的生长因子家族活性蛋白是由Tat与生长因子家族通过基因重组方 式获得的融合蛋白，其特征在于：生长因子家族成员可为aFGF、bFGF、EGF、KGF、TGF 等；

本发明所述的Tat蛋白介导的生长因子家族活性蛋白在透皮转运中可以皮肤适用的任何形 式存在，其特征在于：皮肤适用的形式可以为冻干粉针、溶液剂、凝胶剂、喷雾剂、乳剂、 膏剂和霜剂等；

本发明所述的Tat与生长因子家族蛋白形成的融合蛋白在透皮转运中应用时，可将融合 蛋白包裹于脂质体内；

本发明所述的Tat蛋白介导的生长因子家族活性蛋白在透皮转运中应用时，可将Tat通过 化学和(或)物理的方法链接到天然或合成的磷脂中并制备成包裹生长因子的脂质体，即以 Tat对脂质体进行修饰，其特征在于：所选用的磷脂可以是天然的或合成的磷脂；