[发明专利]一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其编码基因

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其基因的克隆。

技术背景

木聚糖是一种杂合多聚五碳糖，主链绝大部分都是都是D型吡喃木糖通过β-1，4糖苷键连接，主要的侧链取代基有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、4-0-甲基葡萄糖醛酸、乙酰基、半乳糖基等。木聚糖是半纤维素的主要成分，占植物碳水化合物的1/3，是继纤维素之后的第二大可再生资源。所以，水解木聚糖是利用半纤维素的重要步骤。木聚糖酶广泛用做饲料工业的添加剂、食品工业的改良剂、和造纸工业中纸浆的生物漂白剂等(Polizeli等，2005)。

木聚糖酶最早应用于饲料工业。木聚糖酶能破坏植物细胞壁，将营养物质释放出来，提高养分的利用率(Kim等，2005)。另外木聚糖酶能降低食糜的粘度，提高饲料的表观代谢能(Eun等，2006)。总之，木聚糖酶作为饲料添加剂，能有效的解除木聚糖的抗营养作用。食品工业方面，木聚糖酶能改善面包的质量；降解木聚糖生成具有保健功能的低聚木糖；在酿酒工业中，木聚糖酶降解木聚糖，能提高发酵效率，改善口感等。

木聚糖酶在工业中最重要的应用是作为造纸工业中纸浆的生物漂白剂。木聚糖酶能降解凝结于纤维表面的半纤维素，增加漂白剂与纤维的接触面积，提高漂白效率。但是，在利用木聚糖酶进行预漂白时，纸浆为温度较高的碱性浆，PH值在8.0以上，温度在60℃左右，这就要求所用的木聚糖酶具有耐碱和耐高温的特性(Ahlawat等，2007)。同时，造纸工业中使用的木聚糖酶不能同时具有纤维素酶活性，以免降解纸浆中的纤维，影响成浆质量(Subramaniyan and Prema，2000)。

到目前为止，国内外已有300余种不同来源的木聚糖酶基因的报道，细菌、真菌、链霉菌、植物和原生动物中均有报道(Srivastava等，1991；Suzuki等，2002；Devillard等，1999)，其中100多种基因在合适的宿主中被克隆和表达(Wamalwa等，2007)。但是，由于木聚糖酶产量不高或酶的耐受性不够等问题，以至于酶在工业上的大规模使用受到限制。而解决这一问题的方法主要有：1、对现有的木聚糖酶进行遗传改造，提高酶的性质；2、从极端环境中筛选优良的木聚糖酶产生菌，并获取优良理化性质的木聚糖酶基因。尤其是后者，已成为广泛应用木聚糖酶降低生产成本的突破口之一。

随着时间的推移，陆地资源日渐贫瘠，而世界海洋占据了地表面积的70％以上，是一个巨大的生物资源的宝库。海洋环境包括了高压、低温、无光照、局部的高温、高盐等生命极限环境，以及从营养丰富区到只有少数微生物能生存的营养馈乏区等等，生态环境非常复杂而多样。在这样的生态环境下，海洋的微生物在长期的进化中，发展了一些独特的结构和功能，以维持其生命活动。海洋微生物的复杂多样使其产生的代谢产物也具有多样性、复杂性和特殊性，因而海洋微生物成为重要的基因库和开发新颖生物活性物质的极好的天然资源。

因此，利用海洋微生物生态环境的复杂和多样性，从中筛选耐受高压、高盐、低温等极端性质的木聚糖酶类是海洋微生物研究与开发的一个很好的方向。海洋微生物的木聚糖酶在环境保护、食品加工和其它生物技术过程中具有很大的应用潜能。

发明内容

本发明的目的是提供一种性质优良、适合于在造纸工业中应用的木聚糖酶及其编码基因，为进一步通过基因工程的方法，利用重组生物反应器来工业化生产廉价木聚糖酶提供很好的基因资源。

本发明人从国家海洋局第三研究所提供的深海细菌中筛到一株被命名为Kocuria sp.Mn22的天然菌株，它所产生的木聚糖酶(简称为Kxyn)适合在造纸工业中使用。该木聚糖酶具有高活性，良好的耐碱性和热稳定性、对十二烷基磺酸钠(SDS)也有一定耐受性，而且没有纤维素酶活性，只特异性降解木聚糖。Kxyn最适pH为8.5，在不同pH缓冲液中4℃过夜处理后，在pH7.5-12的范围内维持80％以上的酶活性；最适温度为55℃，在60℃处理一小时，酶活为30％左右；5mM SDS处理后还有90％的酶活。以羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、槐豆胶、桦木木聚糖和燕麦木聚糖为底物测定Kxyn的底物特异性，Kxyn只降解木聚糖，酶活分别为132±1IU/mg和22±2IU/mg，对桦木木聚糖的Km为5.4mgml^-1，Vmax为272μmol min^-1mg^-1。