[发明专利]香蕉线条病毒检测方法所用的PCR引物及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测香蕉线条病毒的引物及其检测试剂盒。

背景技术

香蕉是中山市水果业的支柱产业和重要的出口农产品，远销日本，在日本市场有着良好的口碑，年出口值约十万美元。目前香蕉病毒病一直是我国香蕉生产和香蕉组培苗出境的主要限制因素之一，近年来，香蕉病毒病对中山市的香蕉产量和质量也产生了严重的影响，已成为中山市香蕉产业发展的主要限制因素之一。另外，香蕉一旦被病毒侵染，很难用药剂防治。对付香蕉病毒病，最有效的措施就是预防为主。出于对进口食品检疫安全的关注，日本厚生劳动省几次派员来中山视察香蕉生产情况。而对香蕉种苗特别是对香蕉组培苗的病毒早期检测已经成为控制香蕉病毒病发生蔓延和保障其顺利出境的非常有效的措施。综合上述情况，我们认为有必要在中山市开展香蕉病毒病的普查工作和相关的快速检测技术研究工作，这些工作的开展必将为中山市香蕉产业健康发展做出积极的贡献。

香蕉病毒病一直是我国香蕉大田生产和香蕉组培苗出境的主要限制因素之一。近年来，香蕉病毒病对中山市的香蕉产量和质量都产生了比较严重的影响，也已成为中山市香蕉产业发展的主要障碍之一。为了保障中山市香蕉产业可持续健康的发展，中山出入境检验检疫局利用人才和仪器优势资源，首次对中山市主要香蕉生产基地进行了病毒病普查并对本市香蕉主要病毒进行了分子检测方法的相关研究。按照不同生长季、不同品种进行采样，分别于2007年4～5月、10～11月和2008年4～5月、10～11月间，先后到民众镇、火炬开发区、横栏镇、南朗镇、坦洲、黄圃镇和五桂山镇等香蕉主要生产区镇的香蕉生产基地进行大面积的实地调查和样品采集，调查面积约为1000亩左右，并通过对蕉农咨询来了解香蕉病毒病历年发生与危害的情况，调查和采样的香蕉种类有：香蕉、粉蕉和大蕉，共采集花叶、褪绿、矮缩等病毒症状的可疑样品200份。对采集的样品首先采用血清学方法进行筛选检测，主要是通过ELISA方法；然后根据ELISA检测结果，对阳性结果和可疑结果样品再用现代分子生物学方法如PCR检测法进行针对性检测，尤其是对ELISA检测呈阳性反应的样品进行重点检测和确证，最后再对血清学检测和分子检测都为阳性的样品结果进行核酸序列测定，以便对病毒种类进行终级判定。综合血清学、PCR和序列分析检测结果，发现中山市侵染香蕉的主要病毒种类有三种，它们分别是：香蕉束顶病毒(BBTV)，总BBTV病样100个(86.2％)；香蕉花叶心腐病毒(CMV)，总CMV病样26个(22.4％)；香蕉线条病毒(BSV)，总BSV病样10个(8.6％)。

另外，我们对血清学检测和PCR检测都为阳性的样品进行克隆并进行核酸序列测序：首先采用载体pGEM-T进行克隆，构建重组质粒；然后采用抗生素和α—互补法筛选重组质粒；经PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，扩繁菌体及抽提并纯化质粒后，再利用通用测序引物对重组质粒进行序列测定，分别得到三条序列，分别定名为CMV-ZS、BSV-ZS和BBTV-ZS。经与GenBank中的核酸序列比发现：所得序列的确分别来自黄瓜花叶病毒CMV外壳蛋白基因、香蕉线条病毒BSV外壳蛋白基因和香蕉束顶病毒BBTV复制酶基因；BBTV-ZS(中山分离物)与登陆号为AF246123的中国分离物同源性最高为98.9％，与登陆号为AY222303及AM055641的印度分离物同源性最低为92.6％；CMV-ZS(中山分离物)与登陆号为AG585521的澳大利亚243株系同源性最高为98.9％，与登陆号为CMO304397及CMO304397的ALS分离物同源性最低为69.1％；BSV-ZS(中山分离物)与登陆号为DQ451009的中国广东分离物同源性最高为100％。

BBTV是DNA病毒，目前，也有人用PCR检测香蕉线条病毒，但是其相关试剂盒一般都是多步骤加入PCR试剂，不仅非常容易交叉污染，还费时费力，检测灵敏度也不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测香蕉线条病毒的引物及其检测试剂盒，用本发明试剂盒进行检测，大大地简化了操作过程，减少了PCR操作过程中的污染，能大大降低交叉污染的机率，又使检测效率大幅度提高，同时检测灵敏度也非常高，操作简单方便，防止交叉污染。

本发明提供的技术方案是：一种用于检测香蕉线条病毒的PCR检测引物，其上游引物5′-GGA ATG AAA GAG CAG GCC-3′，下游引物5′-AGT CAT TGG GTC AAC CTC TGT CCC-3′。

一种香蕉线条病毒检测的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品香蕉DNA，备用；