[发明专利]两种异黄酮类化合物制备方法及其抗肿瘤与抗植物病菌用途

说明书

技术领域：

本发明涉及用内生真菌YT2-02生产两种异酮类化合物的生产方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。

背景技术：

有关异黄酮类化合物的文献报道较多，但是从内生真菌发酵培养液中分离制备这类化合物未见报道。本发明人研究得知，内生真菌YT2-02液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞增值抑制活性，遂对其活性成分进行了研究。研究发现所示异黄酮类化合物具有抗肿瘤活性和抗植物病菌作用，目前尚未见从内生真菌中分离培养制备具有细胞增殖抑制活性的异黄酮化合物的报道，抗肿瘤药物市场上也尚未见有与此有关的药物。

发明内容：

本发明旨在提供两种具有很强的细胞增殖抑制抗肿瘤活性与抗植物病菌的化合物的新制备途径。两种化合物的结构式分别是：

        化合物I                        化合物II

本发明采用MTT法测试了化合物I II对HCT-8、A549、BEL-7402、BGC-823和A2780细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，化合物I II对这两种肿瘤细胞均有抗肿瘤作用；本发明采用碟纸片法测得化合物抗真菌活性。化合物I II对几种植物致病菌生长均有抑制活性。

因此本发明的化合物I II可用作肿瘤细胞细胞增殖抑制剂或化合物I II可用于生物农药。

本发明的化合物I II可通过微生物发酵培养来获取，含有该异黄酮类化合物的发酵物，经硅胶柱层析、制备HPLC等方法分离纯化得到。

本发明的下述实施例中列举了利用内生真菌YT2-02制备本发明式化合物I II实例及化合物I II抑制多种肿瘤细胞增殖抑制和抑制植物病菌实例。

本发明的内生真菌采自广西北海围洲岛海绵样品及鱼藤根中分离得到的一株代号为YT2-02的内生真菌，该菌株微生物具有形状球形，丰茂的白色气生菌丝，分生孢子梗分枝次数为2-3次。

需要特别说明的是化合物I II结构中含有多个手性碳，目前尚不能大规模的合成生产；文献报道化合物I在植物中含量非常低，也不适宜大量生产获取；化合物I II具有抑制多种肿瘤细胞增殖活性及抑制植物病菌活性。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物I II的化学结构分别是：

实施例1 化合物I II的发酵生产及分离精制

1 发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取内生真菌YT2-02适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养3天。

取斜面培养3天的内生真菌YT2-02适量，接种到装有120mL培养液[培养基组成(克/升)：麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH₂PO₄ 0.5，MgSO₄ 0.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL锥型瓶中，在28℃、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获得内生真菌的种子培养液。按10％接种量将该种子培养液接种于装有200毫升优化后的生产培养液，培养基组成(克/升)：可溶性淀粉30g，蔗糖10g，麦芽糖20g，蛋白胨6g，酵母膏2g，黄豆粉4g，谷氨酸钠0.5g，七水硫酸镁0.08g，磷酸二氢钾1.2g，装载于28℃、140转/分钟的摇床上，进行为期10天的生产发酵，获得菌丝体和发酵液。

2 浸膏的获得

用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓缩至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。发酵液减压浓缩为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共48.0克。

3 化合物的分离精制

浸膏(48.0克)用氯仿-甲醇(9:1)混合溶剂溶解后，加100克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以环己烷、环己烷-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为10个流份。Fr-2(12g，氯仿-甲醇50：1洗脱物)，以氯仿-甲醇(20：1)为溶剂进行硅胶柱层析，再经HPLC以甲醇-水(70：30)为溶剂得化合物I(折算得3.6g)；Fr-3(4.8克，氯仿-甲醇15：1洗脱物)，再经半制备HPLC(甲醇-水65：35)得化合物II(折算得2.1g)。