[发明专利]产棒曲霉素真菌环介导等温扩增快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种产棒曲霉素真菌环介导等温扩增快速检测方法。

背景技术

棒曲霉素(Patulin)是青霉属、曲霉属、裸囊菌属等多种真菌的次生代谢产物，在果品、蔬菜、果蔬汁、果酒等食品中都有发现。棒曲霉素在动物实验中能引起动物的致畸性、致突变性和致癌性，所以引起了世界各国卫生、毒理医学、食品生产和安全等方面专家学者的极大关注，世界卫生组织(WH0)规定了食品中棒曲霉素的最高限量为50μg/L，目前欧盟已有更严格要求的趋势。果制品中的棒曲霉素主要来源于青霉病，此病危害成熟或接近成熟的果实，病斑黄白色，近圆形，果肉腐烂呈锥状湿腐，当条件适宜时，使全果腐烂，产生强烈的霉味，能产生棒曲霉素的有毒真菌有：展青霉、扩张青霉、棒状青霉、土曲霉等。果汁中的棒曲霉素含量与原料品质、贮藏时间有关，通过调查实验表明，采后立即加工生产的浓缩苹果汁中棒曲霉素的含量最低，而随着贮藏时间的延长，产品中棒曲霉素含量呈增加趋势。一般而言，食品含有棒曲霉素并不会引起急性中毒反应，但动物测试发现，服食过量的棒曲霉素，会引致肠胃充血、扩张、出血和溃疡。联合国粮食及农业组织/世界卫生组织联合食物添加剂专家委员会在1990年及1995年先后就棒曲霉素进行风险评估，报告指出棒曲霉素有基因毒性，动物测试亦显示棒曲霉素会抑制免疫反应、毒害神经，以及影响胎儿发育。

现有棒曲霉素及相应霉菌的检测方法主要有微生物法、纸色谱法和高效液相色谱法，但果汁行业都以高效液相色谱法作为检测棒曲霉素的标准方法，这种方法准确却成本偏高。目前尚未见用环介导等温扩增方法检测产棒曲霉素真菌的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种产棒曲霉素真菌环介导等温扩增快速检测方法，以克服现有技术的缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10⁹拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。

本发明涉及的产棒曲霉素真菌环介导等温扩增快速检测方法，其中包括的试剂如下(1)-(4)：

(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液：

其中包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—8mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引内物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游内引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜碱；

上游内引物：

5-ATATGCATTGGTGACGCTGCGG-ATGGTGATTGCTTTCCCTGA-3、

下游内引物：

5-GACTGGGAGAACAGTTTCGCGA-ACTTTTCCAAGTACGGGGTG-3、

上游外引物：5-TCGGACGAATTGACGTGATT-3、

下游外引物：5-TGAAGGAGCTCTGCACGATA-3、

其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。

其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷—盐酸(Tris—HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、20mmol/L硫酸镁(MgSO₄)和1％曲拉通X—100(Triton X—100)；

(2)UNG酶：1U/μL；

(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；