[发明专利]二化螟对三唑磷靶标抗性的分子检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及二化螟(Chilo suppressalis Walker)对三唑磷(Triazophos)靶标抗性的分子检测方法，属于生物技术领域，专用于二化螟对三唑磷靶标抗性的高灵敏度快速检测。

(二)背景技术

水稻是人类重要的粮食作物，世界上约有50％的人口以稻米为主食，占全球谷类作物种植面积的1/3。水稻也是我国的主要粮食作物，全国50％的人口以稻米为主食，水稻种植面积占谷物播种面积的26.6％，稻谷总产占粮食总产的43.6％，稻谷生产对我国粮食单产和安全性影响最大。二化螟(Chilo suppressalis Walker)是水稻主要害虫，在我国所有水稻种植区均有广泛分布。上世纪90年代以来，我国稻螟灾害接近和超过历史最高水平，其中二化螟灾害尤为严重，沿长江流域和江浙沿海是其最主要发生区(盛承发等2003)，历来主要靠化学防治。20世纪80年代以前，防治的药剂主要有六六六、敌百虫、对硫磷、甲基对硫磷和杀虫脒等；80年代至90年代中期，杀虫单和甲胺磷等被大量广泛应用；90年代初推广使用三唑磷；90年代末氟虫腈及阿维菌素开始用于稻螟的防治。抗药性的发展是持续影响二化螟大爆发的最主要的原因(曲明静博士论文，二化螟对三唑磷的抗性及其机理研究)。

三唑磷(Triazophos)是一种广谱、高效的有机磷杀虫杀螨剂，1971年联邦德国赫斯特公司(Hoechst AG)首先开发，上世纪90年代初开始被用于防治二化螟。经过十多年使用，一些地区种群对三唑磷的抗性也逐渐显著，个别使用较早地区的二化螟种群对其已产生极高水平抗性。昆虫对杀虫剂产生抗性的生理生化机制，主要包括表皮穿透速率降低、解毒酶活性的升高、靶标不敏感性；而靶标不敏感性是最主要的抗性机制。三唑磷在二化螟体内靶标是乙酰胆碱酯酶，而乙酰胆碱酯酶(AChE)的基因突变是导致抗性产生的最主要的原因。本发明中的突变位点是二化螟AChE I的保守基序‘FGESAG’中的A314S突变。

目前关于二化螟对三唑磷抗性的检测局限于生物测定，而生物测定的局限性使得这种常规的检测方法不能检测早期抗性或低频率抗性等位基因。同时，生物测定技术普遍存在以下缺点：(1)灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性等位基因，尤其是抗性等位基因是隐性或不完全隐性时；(2)周期长：生物测定结果一般需要24小时以上，二化螟对三唑磷的生测结果检查时间为48小时；(3)对试虫数量要求很大：测定一个标准曲线至少需要400头试虫，且对昆虫饲养的要求也很高。对于二化螟的生测还要要求试虫的大小一致，从而导致生测的工作量加大，并且诸多人为因素也会影响生测结果。随着三唑磷的大量应用以及抗性的逐步产生，我们迫切需要一种快速、方便、灵敏的抗性检测方法。

(三)发明内容

技术问题本发明的目的是针对现有技术中二化螟对三唑磷抗性检测方法灵敏度低、周期长、材料要求高等问题，提供二化螟对三唑磷靶标抗性的分子检测方法，达到准确性高、周期短、灵敏度高的目的。

技术方案

二化螟对三唑磷靶标抗性的分子检测方法，用特异性引物：

F：5′-GGGCAAGAAAGTAGACGCCTGGTT-3′

R：5′-GTTCGTCAGCACTCTTCTTCCTTA-3′

扩增二化螟的基因组DNA，PCR扩增产物用限制性内切酶MspAl I进行酶切消化，如果得到片段为534bp和224bp时，说明该二化螟个体是对三唑磷靶标敏感纯合子SS；如果得到片段为758bp时，说明该二化螟个体是对三唑磷靶标抗性纯合子RR；如果得到片段为758bp，534bp和224bp时，说明该二化螟个体是对三唑磷靶标抗性杂合子RS。

二化螟基因组DNA的提取方法为，采用生工UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽提试剂盒：

1.取单头四龄二化螟，在液氮中磨成粉末，并转移置1.5ml的离心管中；

2.然后加入300μl ACL溶液和20μl的蛋白酶K；

3.震荡混匀1分钟，然后置于55℃放置1—3小时；

4.取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀，然后12000rpm离心5分钟；

5.吸取300μl上清至UNIQ—10柱子，然后再吸取300μl的AB溶液至UNIQ—10柱子中，上下颠倒混匀2—3次，室温静置3分钟；

6.3000rpm离心3分钟，取下UNIQ—10柱子，倒掉收集管中废液；

7.将UNIQ—10柱子放回收集管中，加入500μl洗脱溶液，8000rpm，室温离心30秒；