[发明专利]筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于环境监测及卫生防疫领域，具体涉及一种快速筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器及其构建方法。

背景技术

环境雌激素类化合物是指存在于环境中的能够干扰体内分泌系统的一大类化合物，又称为环境雌激素。在雌激素类化合物的体外检测方法中，以用基因重组酵母检测评价环境雌激素较为常见。常用的方法是将人雌激素受体(hER)基因、雌激素效应元件(ERE)及编码β-半乳糖苷酶的LacZ基因(报告基因)重组于酵母细胞，使β-半乳糖苷酶的表达量在雌激素的调控之下。β-半乳糖苷酶可催化底物ONPG(邻-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖)显黄色，通过颜色的深浅甄别或检测雌激素类化合物。但这种方法需要破坏酵母细胞壁。不同的破壁方法对实验结果影响较大；酶活性受时间、温度、pH、菌液浓度的影响较大，而且耗时长，费用高；所用试剂较多，某些具有致癌性，对环境有一定的污染。

发明内容

为了解决现有检测方法耗时长，费用高，有污染的不足，本发明提供了一种快速筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器，用于环境雌激素检测，有效地解决了问题。

本发明采用的技术方案是：

一种筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器，其特征在于，是一种基因重组酵母，该基因重组酵母带有外源hER(人雌激素受体)基因、ERE(雌激素效应元件)以及yEGFP(酵母增强绿色荧光蛋白)，yEGFP的表达受ERE的调控。

作为本发明的一个具体的技术方案，所说的全酵母细胞传感器可以是W303-1A/hER-ERE-yEGFP，即在W303-1A酵母细胞中重组有hER、ERE和yEGFP，且yEGFP的表达受ERE的调控。结构特征如图1所示，传感器中主要由2个附加型酵母载体构成：(1)表达载体(pYG/hER)由酵母较强启动子GPD(3-磷酸甘油醛脱氢酶)启动子驱动hER(人雌激素受体)表达；(2)报告载体(pLZ-yEGFP)的yEGFP(酵母增强绿色荧光蛋白)的表达是在ERE的调控之下。

所说的酵母细胞，除W303-1A外，其他有Trp-和Ura-表型的酵母细胞也适用于本发明。

上述所说的筛选雌激素类化合物的全酵母细胞传感器的构建方法是：

1)利用基因工程技术构建hER cDNA酵母表达载体，并用该载体转染酵母细胞；

2)构建ERE调控的yEGFP报告载体；

3)将步骤2)的报告载体转化于步骤1)的转染酵母细胞中，使yEGFP的表达置于雌激素受体的调控之下，得到的转化子即本发明的发光全酵母细胞传感器。

绿色荧光蛋白(GFP)最初是从水母(Aequorea Victoria)中分离出来的，当受到紫外光(UV)或蓝光激发，后能够发射强烈绿色荧光的蛋白质。GFP有许多优点，如发光的特异性与物种无关，不需要底物及辅助因子或其他蛋白质。这样可将ERE与GFP相串联，使GFP的表达处于ERE的调控之下，构建成一种生长快，且能在廉价的培养基上生长的基因重组酵母细胞传感器，其GFP的发光程度与环境中雌激素类化合物的污染程度具有量效关系。当雌激素类化合物作用于该细胞传感器时，会使人雌激素受体蛋白(hER)发生变构效应，经ERE顺式激活GFP基因表达，通过测定GFP的发光强度来评价环境中雌激素类化合物的污染程度。用GFP作为报告基因，会克服用酶作为报告基因不经济、可比性差等缺点，也省却了对酵母破壁的繁琐操作，可直接测其荧光强度，具有方便、快速、稳定性好、对环境无污染等特点。

传统的以酶作为报告基因的酵母细胞传感器，需要添加底物、缓冲液及相关试剂，如磷硝基苯酚、邻-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖、β-巯基乙醇等，有些具有致癌性，会对环境造成一定的污染，而且操作繁琐、费时、成本高。

而以yEGFP为报告基因所构建的发光酵母细胞传感器，不需要添加任何底物和辅助试剂，安全，对环境无污染，而且操作方便、时间短(仅需4小时)，费用低。

附图说明

图1 本发明全酵母细胞传感器示意图

图2 本发明全酵母细胞传感器工作原理图

图3 yEGFP在酵母细胞中的表达

A：空白对照；

B：1nmol/L雌二醇诱导后；

C：10nmol/L雌二醇诱导后。

图4 是pGDP212质粒结构示意图

图5 是pMP208质粒结构示意图

图6 是阳性受试物Logistic剂量效关系

具体实施方式

文中所用到的质粒或细胞：

MCF-7：购自中科院上海细胞研究所