[发明专利]一种能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物

说明书

技术领域

本发明涉及抗白血病的药物，尤其是一种能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物。

背景技术

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是恶性肿瘤化疗失败的主要原因，也是常规化疗难以使白血病获得长期缓解的重要障碍。研究表明，由mdr1基因编码的p-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)在肿瘤细胞表面过度表达是导致肿瘤细胞多药耐药主要机制。大约30％的急性粒细胞性白血病(AML)患者在初诊时就有P-gp的表达，而大于50％的AML复发患者有P-gp的表达。因此，以P-gp为靶点逆转肿瘤细胞耐药成为提高白血病化疗疗效的重要手段。目前临床应用的耐药逆转剂如维拉帕米和环胞菌素A等虽然有一定效力，但它们是P-gp的底物，是P-gp较弱的抑制剂，而且在有效药物浓度下毒性较大，产生严重不良反应，限制了其临床应用。

RNA干扰(RNA interferance，RNAi)是高度特异的mRNA水平上的基因沉默机制，能高效特异性地抑制靶基因表达。由于RNAi有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此无论是在功能基因组研究，还是肿瘤的基因治疗方面均具有广阔的应用前景。与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，RNAi技术具有明显的优点：它比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变；与DNA技术造成的功能永久性缺失相比，RNAi技术更为安全。目前，用于RNA干扰的核苷酸片段分为两种：小干扰RNA(siRNA)和编码小发夹RNA(shRNA)，但siRNA片段可能在转染过程中降解或因细胞分裂而溶解消失使其不能稳定持久地发挥作用，而编码小发夹RNA(shRNA)质粒载体的运用可克服这种局限，从而使得利用RNAi长期封闭基因或抑制基因表达得以实现。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够逆转白血病多药耐药的RNA干扰药物，通过构建针对mdr1的RNA干扰载体，在mRNA水平和蛋白水平逆转白血病多药耐药。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：设计针对多药耐药基因mdr1的RNA干扰序列，构建表达shmdr1的载体(pGE-shmdr1)，RNA干扰序列为针对mdr1mRNA序列不同位点设计的小发夹状RNA片段，分别命名为shmdr1-1，shmdr1-2，shmdr1-3，shmdr1-4，将上述4个片段分别连接到pGE-1载体中，组成的RNA干扰载体为pGE-shmdr1-1，pGE-shmdr1-2，pGE-shmdr1-3，pGE-shmdr1-4，所述的RNA干扰载体药物为pGE-shmdr1-1。关于重组DNA技术，其方法详见《分子克隆实验指南》第三版黄培堂等译p68页。

shmdr1-1，shmdr1-2，shmdr1-3，shmdr1-4四个片段的核苷酸序列为：

shmdr1-1：

5-GATCCCGAAACCAACTGTCAGTGTATCAAGAGTACACTGACAGTTGGTTTCTTTTTT-3

3-GGCTTTGGTTGACAGTCACATAGTTCTCATGTGACTGTCAACCAAAGAAAAAAGATC-5

shmdr1-2：

5-GATCCCGACAGAAAGCTTAGTACCATCAAGAGTGGTACTAAGCTTTCTGTCTTTTTT-3

3-GGCTGTCTTTCGAATCATGGTAGTTCTCACCATGATTCGAAAGACAGAAAAAAGATC-5

shmdr1-3：

5-GATCCCGGCCTAATGCCGAACACATTCAAGAGATGTGTTCGGCATTAGGCCTTTTTT-3

3-GGCCGGATTACGGCTTGTGTAAGTTCTCTACACAAGCCGTAATCCGGAAAAAAGATC-5

shmdr1-4：

5-GATCCCGATCGCTACTGAAGCAATATCAAGAGTATTGCTTCAGTAGCGATCTTTTTT-3

3-GGCTAGCGATGACTTCGTTATAGTTCTCATAACGAAGTCATCGCTAGAAAAAAGATC-5

所述的shmdr1-1，shmdr1-2，shmdr1-3，shmdr1-4的靶位点为：

shmdr1-1：5-GAAACCAACTGTCAGTGTA-3  508-526